沈亦萱，馬玉清，馬越，張紅，霍斌，王曉慶

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科，蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 2015級臨床醫(yī)學(xué)1班，蘭州 730000)

神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)元敏感性改變所致的難治性疼痛，周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)元敏感化是誘發(fā)異常疼痛的原因，阿片類藥物治療效果不佳。新的靶分子導(dǎo)向的止痛劑備受期待。神經(jīng)損傷后不可避免地激發(fā)神經(jīng)元炎癥反應(yīng)。神經(jīng)元炎癥反應(yīng)介導(dǎo)神經(jīng)組織的修復(fù)和再生，參與慢性疼痛的發(fā)生。研究表明，高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)是一族含量豐富的非組蛋白核蛋白，氨基酸序列高度保守，可促發(fā)神經(jīng)元炎癥反應(yīng)。通過靶向抑制HMGB1表達(dá)可減輕神經(jīng)性疼痛，阻斷HMGB1通路可能是治療神經(jīng)性疼痛的有效途徑[1]。Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是與免疫或炎性疾病密切相關(guān)的模式識別受體，與相應(yīng)受體結(jié)合后激活NF-κB(nuclear transcription factor)信號通路，釋放細(xì)胞因子，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)。丹參酮 (tanshinone)是中藥丹參根的脂溶性成分，含有鄰醌或?qū)︴Y(jié)構(gòu)。丹參酮ⅡA (tanshinoneⅡA，Tan ⅡA)是丹參酮中含量最高、活性最穩(wěn)定的成分，有明確的分子結(jié)構(gòu)，有一定的抗炎和抗氧化作用。Tan ⅡA 可通過抑制環(huán)氧化酶-2(COX2) 的過表達(dá)和膠質(zhì)細(xì)胞活化，抑制神經(jīng)元炎癥反應(yīng)(2)。筆者在本研究將建立脊神經(jīng)選擇性結(jié)扎(spinal nerve ligation，SNL)疼痛模型，在細(xì)胞和分子水平探討HMGB1-TLR4信號通路在神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制及Tan ⅡA對疼痛模型大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康成年雄性無特定病原體(SPF) 級 Sprague-Dawley(SD)大鼠，甘肅中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(甘)2011-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK(甘)2011-0001，體質(zhì)量 200～240 g，動物脊髓取腰( lumbar，L) 4～6(L4～L6)節(jié)段。

1.2主要試劑 兔抗大鼠 HMGB1 多克隆抗體(ab 11354)、TLR4 多克隆抗體(ab 22408)和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，試劑盒購自Abcam公司；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素10(IL-10)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；丹參酮 ⅡA 磺酸鈉注射液(STS，上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號：130408)，其輔料為葡萄糖和注射用水；10%水合氯醛溶液(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科)。

1.3主要儀器 熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(CF×96 Touch TM，Bio-Rad 公司)；濕轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad 公司)；圖像分析系統(tǒng)(ChemiDocTMMP Imaging System，Bio-Rad 公司)；微顯紫外分光光度計(BioMateTM3SSpectrophotometer，美國Thermo scientific公司)；BIO-RAD伯樂酶標(biāo)儀(美國Thermo scientific公司)；Von Frey 纖維(美國stoleting 公司)；PL-200 熱刺痛儀(成都泰盟科技有限公司)。

1.4脊神經(jīng)結(jié)扎疼痛模型(SNL)的建立 參照文獻(xiàn)[3]的方法制備 SNL 疼痛模型。腹腔注射10%水合氯醛 300 mg·kg-1麻醉大鼠，大鼠髂棘連線為 L5～L6間隙，在 L4至L1(S1)脊柱中線偏左 0.5 cm 處作長1.5 cm的縱行切口，鈍性分離左側(cè)椎旁肌肉，暴露 L6橫突和骶骨夾角，去除部分 L6橫突，鈍性分離 L5、L6脊神經(jīng)，用 6～0號醫(yī)用絲線緊緊結(jié)扎 L5脊神經(jīng)，并在線結(jié)遠(yuǎn)端 5 mm 處剪斷 L5脊神經(jīng)[4]。假手術(shù)組大鼠操作與手術(shù)大鼠相同，只暴露 L5脊神經(jīng)而不結(jié)扎。

1.5動物分組與處理 成年雄性SD大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為 3 組：假手術(shù)組、模型對照組和 Tan ⅡA 組，每組根據(jù)處死時間分為 3 小組：第3天組、第7天組和第14天組(n=6) 。SNL術(shù)畢即刻，Tan ⅡA組腹腔注射 STS 30 mg·kg-1·d-1，連續(xù)14 d，而假手術(shù)組和模型對照組腹腔注射等體積注射用水。

1.6痛閾測定 參照文獻(xiàn)[5]方法，以Von Frey 纖維絲測定大鼠 50% 縮足反應(yīng)閾值(paw withdrawal threshold，PWT)，采用 PL-200熱輻射儀測定大鼠的熱刺激縮爪潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)。

1.7實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測大鼠腰段脊髓 HMGB 和TLR4mRNA的表達(dá) 登錄 Genebank，根據(jù)大鼠 HMGB1 和 TLR4 全長基因序列，應(yīng)用 Perkin- Elmer Applied Biosystems 提供的 Primer Express soft ware 設(shè)計引物，由上海生物工程有限公司合成，目的基因引物、序列和長度見表1。

表1 目的基因引物、序列和長度

Tab.1Primer,sequenceandlengthoftargetgene

目的基因擴(kuò)增長度/bp引物序列HMGB1218上游引物5′AGC AAT CTG AAC GTC TGT CC 3′下游引物5′GTT CTT GTG ATA GCC TTC GC 3′TLR4356上游引物5′GCC GGA AAG TTA TTG TGG TGG T 3′下游引物5′ATG GGT TTT AGG CGC AGA GTT T 3′β-actin372上游引物5′GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA 3′下游引物5′GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG 3′

大鼠腰段脊髓組織(≤30 mg)，按 Total RNA Kit 說明書提取總 RNA，測定總 RNA 的濃度和純度，鑒定 RNA 完整性。以提取的總 RNA 為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit) 說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成 cDNA 第一鏈，-20 ℃保存。以制備的 cDNA 為模板，分別擴(kuò)增β-actin、HMGB1 和 TLR4。cDNA 樣品稀釋10倍，分別進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴(kuò)增，熒光染料法(SYBR Green) 實時監(jiān)測 PCR 產(chǎn)物量，得出熒光曲線，通過cDNA 濃度梯度的對數(shù)值對CT 值作圖比較兩基因擴(kuò)增效率。反應(yīng)體系為：95 ℃預(yù)變性 15 s，95 ℃變性 3 min，55 ℃退火 1 min，44個循環(huán)。采用羅氏公司的 Fast Start Universal SYBR Green Master 試劑盒，在 CF×96 TouchTM熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行目的基因(HMGB1 和TLR4)和內(nèi)參基因(β-actin)擴(kuò)增，取 Ct 平均值，用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)[6]。

1.8Western blotting檢測大鼠腰段脊髓 HMGB和TLR4 蛋白質(zhì)的表達(dá) 采用 BCA 法蛋白質(zhì)定量，在50 μg蛋白質(zhì)/ 泳道中加入等體積 2×SDS 凝膠加樣緩沖液，煮沸使蛋白質(zhì)變性，電泳分離蛋白質(zhì)；300 mA，1 h 用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃封閉過夜；次日，加入稀釋的一抗(anti-HMGB1 mouse IgG，anti-TLR4 mouse IgG，anti-β-actin mouse IgG)，4 ℃孵育2 h；TBST 洗膜 10 min×3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，4 ℃孵育4～8 h；TBST 洗膜10 min×3 次。用 Western blotting 熒光檢測試劑顯色液，顯色1～15 min，顯影后終止反應(yīng)，用凝膠圖像成像系統(tǒng)分析。

1.9ELISA 檢測大鼠腰段脊髓TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白的表達(dá) 脊髓組織稱定質(zhì)量后置于勻漿緩沖液中勻漿，4 ℃，2000×g離心30 min，取上清液待用。在波長450 nm處測定標(biāo)本吸光度(A450值)，通過標(biāo)準(zhǔn)品A值繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程式計算各樣本濃度，利用曲線方程式算出 TNF-α、IL-1β 和 IL-10 的蛋白含量，每組樣品點 3 孔。

2 結(jié)果

2.1Tan ⅡA對SNL大鼠痛敏的影響 SNL手術(shù)增加大鼠后足對機(jī)械性刺激和熱刺激的敏感性，與假手術(shù)組比較，模型對照組、Tan ⅡA 組PWT 和 PWL 均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。模型對照組術(shù)后第3天時大鼠 PWT和 PWL 均較術(shù)前明顯降低(P<0.01)。與模型對照組比較，TanⅡA 組大鼠術(shù)后第3天時 PWT和 PWL 升高(P<0.01)。見圖1。

與假手術(shù)組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01

Compared with sham-operated group，*1P<0.01；Compared with model control group，*2P<0.01

2.2Tan ⅡA對SNL大鼠腰段脊髓HMGB1和TLR4 mRNA表達(dá)的影響 Real-time PCR 檢測大鼠脊髓 HMGB1 和 TLR4 mRNA 表達(dá)水平結(jié)果見圖 2。 與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠在第3，7和14天脊髓 HMGB1和TLR4 mRNA 表達(dá)水平顯著升高，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與模型對照組比較，Tan ⅡA 組大鼠脊髓 HMGB1 和 TLR4 mRNA 表達(dá)水平顯著降低，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (均P<0.05)。

與假手術(shù)組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with sham-operated group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

2.3TanⅡA 對SNL大鼠腰段脊髓HMGB1和TLR4 蛋白表達(dá)的影響 Western blotting 檢測大鼠脊髓 HMGB1 和 TLR4 蛋白表達(dá)水平結(jié)果見圖3，4 。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠在 第3，7和 14天脊髓 HMGB1和TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著增，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組比較，Tan ⅡA 組大鼠脊髓 HMGB1和TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果提示，模型大鼠痛閾變化可能與 HMGB1、TLR4 高表達(dá)有關(guān)。

與假手術(shù)組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05

圖3 3組大鼠SNL術(shù)后不同時間點HMGB1蛋白的表達(dá)變化

Compared with sham-operated group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

2.4TanⅡA對SNL大鼠脊髓TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白表達(dá)的影響 ELISA 法檢測結(jié)果見圖5。與假手術(shù)組比較，模型對照組、TanⅡA 組大鼠第3，7和14天脊髓TNF-α和IL-1β表達(dá)水平增加(P<0.05)；與模型對照組比較，TanⅡA 組大鼠第3，7和14天脊髓TNF-α和IL-1β表達(dá)水平降低(P<0.05)，而IL-10的表達(dá)水平顯著增加，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

本研究采用改良的L5SNL模型，參照文獻(xiàn)方法制備脊神經(jīng)選擇性結(jié)扎切斷模型，行為學(xué)測試結(jié)果顯示，SNL術(shù)后大鼠后足對機(jī)械性和熱刺激的敏感性增加，術(shù)后第3，7和14天大鼠 PWT和PWL明顯降低，表明模型成功。TanⅡA 腹腔注射后大鼠后足機(jī)械性和熱刺激的敏感性降低，術(shù)后第3，7和14天大鼠 PWT和PWL明顯升高，鎮(zhèn)痛作用明顯。

筆者在預(yù)實驗采用30和 50 mg·kg-1的STS腹腔注射用藥，效果無明顯區(qū)別，但50 mg·kg-1時大鼠出現(xiàn)明顯的副作用。因此，根據(jù)藥量藥效學(xué)最佳比例，選擇實驗劑量30 mg·kg-1。Tan ⅡA不易吸收，以水溶性STS 替代以提高生物利用度。

脊髓是調(diào)節(jié)痛覺信號傳導(dǎo)的重要中樞，脊髓水平HMGB1 及其內(nèi)源性配體在神經(jīng)病理性疼痛中作用的研究不多。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組脊髓組織中HMGB1 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)極少，SNL 術(shù)后 第3天，隨著異常痛敏的產(chǎn)生，模型對照組脊髓 HMGB1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯升高。推測HMGB1與病理性疼痛時的機(jī)械性痛覺超敏和熱刺激誘發(fā)的痛覺過敏有關(guān)。研究表明，大鼠神經(jīng)受損后，用HMGB1抗體治療可明顯減輕痛覺過敏，說明HMGB1與神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)[7]。有研究發(fā)現(xiàn) HMGB1 可延長慢性炎癥性疼痛的病理進(jìn)程，推測原因為脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞和背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中HMGB1表達(dá)上調(diào)所致[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，Tan ⅡA 組與 模型對照組比較，大鼠脊髓組織HMGB1的表達(dá)明顯減少，且該組大鼠的PWT和PWL同時顯著減輕。提示腹腔注射 TanⅡA 在產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)的同時，也抑制脊髓組織 HMGBl mRNA和蛋白的表達(dá)，推測HMGB1表達(dá)下調(diào)可能是 Tan ⅡA 發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制。假手術(shù)組大鼠脊髓的 TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)較低，SNL 術(shù)后第3天，伴隨異常痛敏的出現(xiàn)，模型對照組脊髓TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)并維持在較高水平，推測TLR4與機(jī)械痛和熱敏痛有關(guān)。HMGB 與TLR4結(jié)合呈二聚體化，激活 MAPK 和 NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9]，生成大量的細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β，產(chǎn)生痛覺過敏和痛覺超敏[10]，這與本實驗結(jié)果一致。TLR位于神經(jīng)元界面，越來越多的證據(jù)表明TLR激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)、感覺神經(jīng)元和其他細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，影響痛覺傳導(dǎo)，導(dǎo)致疼痛擴(kuò)大和不易治愈[11]。本實驗檢測到TLR4的表達(dá)量較HMGB1少，因為TLR4不是HMGB1的唯一受體，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE) 也與可HMGB1受體結(jié)合，啟動NF-κB信號通路。神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞激活后可釋放一系列的炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等，產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛[12]。本研究還發(fā)現(xiàn)，TanⅡA腹腔注射抑制TLR4和下游炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)，且該組大鼠的PWT和PWL同時顯著減輕，提示腹腔注射TanⅡA產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)的同時，抑制脊髓組織中TLR4 mRNA 及蛋白的表達(dá)，推測TLR4和下游細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)下調(diào)可能是TanⅡA發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制。IL-10可以抑制炎性因子IL-1β、IL-6及脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化所致的疼痛過敏[13]。HMGB1抗體或HMGB1抑制劑對炎性病理性疼痛療效明顯[14]。HMGB1抑制劑(丙酮酸乙酯)可抑制腦損傷模型大鼠的 HMGB1/TLR4/NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和炎癥反應(yīng)，改善模型大鼠的腦水腫[15]。本實驗也觀察到，TanⅡA 可抑制SNL大鼠脊髓 HMGB1、TLR4、TNF-α和IL-1β的表達(dá)，促進(jìn)IL-10的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)SNL所致的熱敏痛和機(jī)械痛。

與假手術(shù)組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with sham-operated group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

與假手術(shù)組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05

TanⅡA可逆轉(zhuǎn)SNL所致的熱敏痛和機(jī)械痛，使HMGB1和TLR4 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)降低，炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β的表達(dá)減少，抗炎因子 IL-10 的表達(dá)增加，抑制HMGB1-TLR4信號通路。表明在L5SNL模型中抑制HMGB1-TLR4信號通路有一定的鎮(zhèn)痛作用，HMGB1-TLR4信號通路與神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)，可作為治療病理性疼痛的靶點。