馮婉瑩， 羅 浩， 黃澤濤

(廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司， 廣東 廣州 511447)

氨基甲酸酯是一類以甲酸酯為前體化合物合成得到的農(nóng)藥，在我國農(nóng)產(chǎn)品行業(yè)中應(yīng)用廣泛[1]。氨基甲酸酯除殺蟲外，還具有促進(jìn)作物生長的效果[2]，因此容易被濫用。而氨基甲酸酯毒性大，且缺乏選擇性，會(huì)對(duì)人類和動(dòng)物健康及水生系統(tǒng)構(gòu)成威脅[3]。相關(guān)研究表明，氨基甲酸酯會(huì)對(duì)外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，肌肉、肝臟、胰腺和腦等器官造成影響[4]。

目前，對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6-7]、氣相色譜- 質(zhì)譜法[8-9]和液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法[10-13]，還有酶抑制法和免疫法[14-15]。氣相色譜法試劑用量大，且需要濃縮，操作煩瑣，不利于大批量檢測(cè)。液相色譜法檢測(cè)限高，或需要進(jìn)行衍生，同樣不適用于日常檢測(cè)。氣相色譜- 質(zhì)譜法對(duì)熱不穩(wěn)定的化合物檢測(cè)難度大。而酶抑制測(cè)定和免疫測(cè)定則存在實(shí)驗(yàn)影響因素多和檢測(cè)成本高等問題。文章基于QuEChERS技術(shù)建立了測(cè)定菠菜中5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC- MS/MS)，該方法操作簡(jiǎn)便、快速高效且回收率高、重現(xiàn)性好，適用于實(shí)驗(yàn)室的日常分析測(cè)定，為相關(guān)檢測(cè)方法的研究提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(霜霉威、滅多威、異丙威、抗蚜威、丁硫克百威)，質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈、甲酸(色譜純)，美國Fisher公司；N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、C18固相吸附劑，安捷倫科技公司；無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠。實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli- Q型凈化系統(tǒng)過濾的超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1200型高效液相色譜- 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB公司；Heidolph Multi Reax型渦旋振蕩器，德國Heidolph公司；TGL- 16MH2050R型高速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Milli- Q型超純水裝置，美國Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別取0.1 mL 1 000 mg/L的氨基甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。取適量10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間液用空白基質(zhì)溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的基質(zhì)工作液，空白基質(zhì)溶液由5種氨基甲酸酯呈陰性的樣品處理后得到。

1.3.2樣品前處理

提?。悍Q取5 g均質(zhì)后的樣品于50 mL離心管，加入10 mL水和10 mL乙腈，渦旋混勻1 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋提取5 min，10 000 r/min離心5 min。

QuEChERS凈化：稱取PSA 固相吸附劑200 mg和無水硫酸鎂50 mg于1.5 mL離心管中，加入上清液1 mL，渦旋2 min，12 000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜后待UPLC- MS/MS測(cè)定。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1色譜條件

色譜柱：Agilent Proshell C18(150 mm×3.0 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；等度洗脫，流動(dòng)相組分比例A∶B為75∶25。

1.4.2質(zhì)譜條件

掃描方式：電噴霧電離源(ESI+)；氣簾氣：25 psi；電離電壓：5 500 V；離子源溫度：500 ℃；霧化氣：50 psi；加熱輔助氣：50 psi；碰撞氣：medium；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multi-reaction monitoring, MRM)模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由于5種氨基甲酸酯農(nóng)藥含有胺基結(jié)構(gòu)，屬于親核型化合物。因此，實(shí)驗(yàn)對(duì)比了乙腈- 水和乙腈- 0.1%甲酸流動(dòng)相對(duì)5種目標(biāo)物響應(yīng)值的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈- 0.1%甲酸作為流動(dòng)相，5種目標(biāo)物在電離源中能更好地離子化，響應(yīng)值更高。同時(shí)調(diào)整了洗脫梯度對(duì)5種氨基甲酸酯進(jìn)行分離，但由于異丙威和抗蚜威極性相近，使用梯度洗脫仍難以使2種化合物分離。而5種氨基甲酸酯的母離子均不一樣，因此，最終采用等度流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。當(dāng)水相超過25%時(shí)，5種氨基甲酸酯出峰時(shí)間均延后，丁硫克百威峰型變寬，所以最終使用流動(dòng)相為乙腈- 0.1%甲酸(體積比75∶25)。5種氨基甲酸酯MRM色譜圖見圖1。

圖1 5種氨基甲酸酯的MRM色譜Fig.1 MRM chromatograms of five carbamate pesticides

2.2 質(zhì)譜分析參數(shù)的優(yōu)化

由于5種氨基甲酸酯農(nóng)藥呈弱堿性，在電噴霧正離子模式下形成的準(zhǔn)分子離子峰中[M+H]+豐度最高。以流動(dòng)注射的方式在電噴霧正離子模式下，對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選擇豐度較高的2個(gè)碎片離子作為定量和定性離子，通過MRM模式分別優(yōu)化各個(gè)離子對(duì)的去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)等參數(shù)條件，以達(dá)到檢測(cè)的最佳靈敏度(見表1)。

2.3 乙腈用量對(duì)回收率的影響

實(shí)驗(yàn)前期優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，渦旋振搖1 min以上基本可完成提取，因此不對(duì)提取時(shí)間詳細(xì)探究；而在純水用量10 mL條件下，探究乙腈用量對(duì)回收率的影響，見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈用量為10 mL時(shí)，5種氨基甲酸酯的回收率基本滿足測(cè)定要求；用量繼續(xù)增加，回收率無明顯變化?？紤]到稀釋倍數(shù)越大，方法檢出限越高，因此選取10 mL為乙腈提取用量。

表1 5種氨基甲酸酯的質(zhì)譜分析參數(shù)

*為定量離子。

圖2 乙腈用量與回收率的關(guān)系Fig.2 Relationship between acetonitrile dosages and recovery rates

2.4 PSA用量對(duì)回收率的影響

菠菜樣品中含有的大量天然色素和其他極性較大的雜質(zhì)對(duì)5種氨基甲酸酯有較大的基質(zhì)效應(yīng)影響。實(shí)驗(yàn)采用PSA、GCB和C18固相吸附劑對(duì)處理后的溶液進(jìn)行凈化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GCB對(duì)5種氨基甲酸酯有較明顯的吸附作用，導(dǎo)致回收率降低，其次是C18。PSA對(duì)5種氨基甲酸酯的吸附較少，且能較好地去除基質(zhì)效應(yīng)，最終選取PSA進(jìn)行凈化；但基質(zhì)效應(yīng)仍較明顯，導(dǎo)致回收率只有40%～50%，因此也需要采用空白基質(zhì)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)。優(yōu)化后選取PSA用量為200 mg，見圖3。

圖3 PSA用量與回收率的關(guān)系Fig.3 Relationship between PSA dosages and recovery rates

2.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限分析

采用外標(biāo)法對(duì)5種目標(biāo)物進(jìn)行定量，將空白基質(zhì)溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液按優(yōu)化后的儀器條件進(jìn)行測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析，所得方程見表2，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 1。結(jié)果表明，5種目標(biāo)物在給定的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，以信噪比RS/N=3和RS/N=10分別計(jì)算出方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ)，異丙威和丁硫克百威分別為0.20 μg/kg和0.50 μg/kg，其他3種化合物分別為0.10 μg/kg和0.25 μg/kg，表明方法靈敏度達(dá)到分析測(cè)定要求。

表2 5種氨基甲酸酯線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.6 精密度、回收率及重復(fù)性分析

選用陰性樣品，以定量限的1、2、10倍進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平分別日內(nèi)進(jìn)行6次平行測(cè)定。菠菜樣品的平均回收率范圍在91.0%～101.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在2.15%～5.57%(見表3)。說明方法回收率高，重現(xiàn)性好，能滿足分析測(cè)定要求。

表3 5種氨基甲酸酯的回收率和精密度

3 結(jié) 論

研究基于QuEChERS技術(shù)結(jié)合UPLC- MS/MS，建立了菠菜中5種氨基甲酸酯的測(cè)定方法。利用PSA對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，有效地降低了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)回收率的影響，大大提高了方法靈敏度。優(yōu)化超高效液相色譜條件后，5種氨基甲酸酯在9 min內(nèi)出峰，且峰型良好。使用空白基質(zhì)曲線進(jìn)行校正，根據(jù)相關(guān)方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)所用方法簡(jiǎn)單便捷，回收率高且精密度高，為氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)研究提供了參考。