吳鳳玉， 鄭 喆， 李 柳， 吳夢盈， 楊昊寰， 楊貞耐

(北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/食品添加劑與配料北京市高等學校工程中心， 北京 100048)

宮廷奶酪，也稱為米奶酒或扣碗酪，是我國北方少數民族的傳統(tǒng)乳制品。這種利用牛乳汁與米酒混合制成的半凝固食品，口感軟嫩爽滑，具有獨特的酒香與奶香，很容易被我國消費者接受。宮廷奶酪口感與風味的形成與其發(fā)酵過程中米酒微生物的作用密切相關[1]。騰軍偉等[2-3]在酒曲中分離得到11株細菌和2株真菌，篩選出1株高產凝乳酶的解淀粉芽孢桿菌； Liu等[4]分析了紹興黃酒中的微生物，發(fā)現芽孢桿菌和明串珠菌等為主要菌屬；Lv等[5]報道傳統(tǒng)米酒發(fā)酵起始物中的優(yōu)勢菌株為乳酸菌和芽孢桿菌；Huang等[6]報道紅曲糯米酒中隨著發(fā)酵的進行，乳桿菌和明串珠菌成為主要菌屬。甜酒曲中也存在豐富的乳酸菌如腸球菌，乳桿菌等。乳酸菌在發(fā)酵過程中可能由于氧和營養(yǎng)成分的變化而產生不同的有機酸[7]，不僅是酸香味的主要來源，還具有抑制有害菌生長的特性[8]。然而，有關米酒微生物發(fā)酵制作的宮廷奶酪中乳酸菌的分離鑒定及其功能特性的研究較少。

研究采集了4種北京市售宮廷奶酪，采用形態(tài)學觀察、生理生化實驗以及16S rDNA分子生物學鑒定方法，結合菌株的抑菌作用、抗氧化活性和產酸能力測定，分離篩選乳酸菌優(yōu)良菌株，為進一步研究開發(fā)功能性乳制品奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗樣品：宮廷奶酪樣品來自4個市售品牌。

指示菌：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、阪琦桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、李斯特菌，菌株由北京工商大學乳品實驗室菌種保藏庫保藏。

1.2 儀器與設備

BX53型顯微鏡，日本Olympus公司；U- 3900型分光光度計，日本HITACHI公司；HZQ- Q型氣浴恒溫搖床，上海一恒科學儀器有限公司；VCX500型細胞破碎儀，美國Sonics公司。

1.3 實驗方法

1.3.1培養(yǎng)基的配制

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、K2HPO4·7H2O 2 g、無水乙酸鈉3.02 g、檸檬酸三銨2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL,將培養(yǎng)基調至pH值6.2，121 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基：向100 mL液體培養(yǎng)基中添加2 g瓊脂，121 ℃，15 min滅菌。

鈣平板培養(yǎng)基：向100 mL固體培養(yǎng)基中添加1 g的碳酸鈣，121 ℃，15 min滅菌。

1.3.2乳酸菌的初篩

取10 g的樣品于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃富集培養(yǎng)，將富集培養(yǎng)的樣品用質量分數0.9%的生理鹽水做梯度稀釋，取合適梯度平板涂布，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落對其進行平板劃線分離純化，得到形態(tài)一致的單一菌落。

1.3.3乳酸菌的復篩

鈣平板實驗：將初篩的菌株活化后用三點法接種到鈣平板培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察是否產生溶鈣圈。

過氧化氫酶實驗: 挑取純培養(yǎng)物1環(huán)于載玻片上，與體積分數3%H2O2混勻，若有氣泡產生，為陽性，反之為陰性。

1.3.4基于16S rDNA的菌種分子生物學鑒定

將樣品送至北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序。測序結果與Gen Bank中已知菌株的相應序列進行比對，利用MEGA 6.0軟件將實驗菌株與選取的序列相似性較高的菌株序列進行對比分析，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.5乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性測定

采用牛津杯法[9]，取200 μL濃度一定的指示菌懸液在LB平板培養(yǎng)基上涂布。將滅菌后的牛津杯放置在平板上，吸取200 μL離心后的發(fā)酵液于牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑大小。

1.3.6乳酸菌羥自由基清除能力測定

樣品制備：將乳酸菌37 ℃培養(yǎng)24 h，6 000 r/min離心，用PBS(pH值7.2)緩沖溶液洗滌3次，重懸。調整菌懸液濃度為109CFU/mL，從而制得菌體細胞。取10 mL調好濃度的菌體細胞懸液置于冰浴中超聲破碎，設置超聲破碎時間為30 min，超聲4 s，間隔5 s，超聲探頭溫度4 ℃。8 000 r/min離心10 min，離心后獲得的上清液即為無細胞提取液。破碎率計算見式(1)。

(1)

式(1)中，N表示原始細胞數量，N0表示破碎后完整細胞數量。

采用Fenton法[10]，取1 mL菌體細胞懸液和無細胞提取物，在試管中依次加入1 mL 0.435 mmol/L 亮綠，2 mL 0.5 mmol/L 硫酸亞鐵，1.5 mL體積分數3% H2O2，37 ℃水浴20 min后在624 nm處測定上清液吸光度。羥自由基清除率計算見式(2)。

(2)

式(2)中，A1表示Fenton試劑、亮綠及樣品的吸光度，A0表示Fenton試劑與亮綠的吸光度，A表示亮綠的吸光度。

1.3.7乳酸菌DPPH自由基清除能力測定

樣品制備同1.3.6節(jié)，向1 mL菌體細胞懸液和無細胞提取物中加入2 mL 0.5 mmol/L DPPH和體積分數95%乙醇溶液，充分混勻，室溫下避光靜置，反應30 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液519 nm處測吸光度。DPPH自由基清除率計算見式(3)。

(3)

式(3)中，A1表示DPPH乙醇溶液與樣品的吸光度，A0表示樣品與乙醇溶液的吸光度，AC表示DPPH乙醇溶液的吸光度。

空白組以等體積的乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液；對照組以等體積的無菌水代替菌體細胞懸液和無細胞提取液。

1.4 數據分析

用SPSS 17.0軟件進行方差分析，Origin 8.6軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌的篩選結果

富集培養(yǎng)的樣品經過稀釋涂布平板法和平板劃線法分離純化后，共得到15株菌株。菌株產酸實驗結果如圖1。與原始MRS培養(yǎng)基pH值相比,除MRSC1菌株以外，其余菌株發(fā)酵液pH值都有明顯下降；其中菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3發(fā)酵液與初始發(fā)酵液相比，pH值下降明顯，培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵液pH值分別低至3.73、3.79、3.71、3.87，產酸效果較其他菌株更好。

圖1 初篩菌株發(fā)酵液pH值Fig.1 pH values of fermentation liquor of isolated strains

對菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3進行鈣平板鑒定、革蘭氏染色、過氧化氫酶實驗以及菌落特性和菌體形態(tài)觀察，結果見表1。4株菌在鈣平板上均有透明圈出現，說明菌株產酸，使得pH值降低，平板中碳酸鈣溶解，形成透明圈。根據其良好的產酸能力、革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶實驗陰性等特性，初步判斷此4株菌為乳酸菌。

2.2 16S rDNA基因序列同源性比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3的16S rDNA基因序列與Gene Bank內已知菌株的相應序列進行對比，通過同源性比對結果構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖2。菌株MRSA2、MRSD3與LeuconostoclactisLMAU40043在同一分支上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率達到100%，因此可將MRSA2、MRSD3鑒定為乳明串珠菌。明串珠菌屬通常存在于乳制品、肉類或其他食品中[11]。與其他乳酸菌一樣，明串珠菌屬是重要的工業(yè)發(fā)酵微生物，用于多種工業(yè)和食品發(fā)酵過程，如奶酪、黃油、酸奶和泡菜的生產[12]。 明串珠菌是乳制品生產中重要的風味微生物[13]，在風味酸奶、干酪生產中應用較多，其通過代謝檸檬酸鹽等有機酸產生的風味物質和CO2等，不僅對發(fā)酵乳制品的風味和組織狀態(tài)有重要影響，還具有潛在的益生作用[14]。

表1 微生物菌落形態(tài)及特性觀察

圖2 4株乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogentic tree of four isolated strains based on 16S rDNA sequence

菌株MRSA1、MRSB1與EnterococcusfaeciumHY07 CP032308在同一分支上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率達到99%，因此可將MRSA1、MRSB1鑒定為屎腸球菌。

2.3 乳酸菌抑菌和抗氧化活性分析

2.3.1抑菌活性分析

菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3在37 ℃發(fā)酵24 h后，發(fā)酵液pH值無顯著性差異(P>0.05)。對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、志賀氏菌、阪琦桿菌6株病原菌的抑菌實驗結果如圖3和表2。這4株乳酸菌對6株病原菌均有抑制作用，MRSA2的抑菌效果最強，對指示菌的抑菌效果顯著高于其余菌株 (P<0.05)，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、阪琦桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌均具有較強抑菌效果，抑菌圈直徑均在16 mm以上。菌株MRSA1對金黃色葡萄球菌有良好抑菌效果，MRSB1對阪琦桿菌和沙門氏菌有良好的抑菌效果，MRSD3對指示菌的抑菌效果較弱。這些菌株的不同抑菌效果，可能與其產生的不同抑菌物質有關。對發(fā)酵液用NaOH溶液調pH值至7，進一步分析抑菌活性，表明4株乳酸菌發(fā)酵液經堿中和后，對6株病原菌的抑菌活性全部消失，由此推測這4株乳酸菌的主要抑菌活性物質為酸性物質。

乳酸菌在發(fā)酵過程中能產生具有抑制腐敗菌的代謝產物，如有機酸、過氧化氫、細菌素和二乙酰等[15]。在中和處理酸性代謝產物后，大多數乳酸菌的抗菌活性喪失[16]。蘇本憲等[17]分析植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、副干酪乳桿菌代謝產物對化膿性鏈球菌的抑制作用，發(fā)現主要抑菌物質為有機酸和H2O2。某些明串珠菌能夠產生抑菌成分，抑制發(fā)酵乳制品中有害菌的生長[18]。李東霞等[19]用牛津杯雙層法從蔬菜廢棄物中篩選出2株具有高抑菌活性的乳明串珠菌，其主要抑菌活性物質為酸性物質，與本研究結果一致。具有良好抑菌活性的明串珠菌可以抑制自然發(fā)酵食品中致病菌的生長，因此具有重要研究意義[20]。

1—MRSA1; 2—MRSA2; 3—MRSB1; 4—MRSD3。圖3 菌株抑菌活性測定Fig.3 Antibacterial activities of strains

菌株發(fā)酵液pH大腸桿菌金黃色葡萄球菌李斯特菌阪琦桿菌沙門氏菌志賀氏菌MRSA13.99±0.04+++++++MRSA23.84±0.06+++++++++++++++++MRSB13.85±0.05++++++++MRSD34.01±0.04++++++

抑菌圈直徑包含牛津杯外徑(7.8 mm)；+：抑菌圈直徑8.00～12.00 mm，抑菌效果較弱；++：12.00～16.00 mm，抑菌效果良好；+++：16.00～20.00 mm，抑菌效果較強。數值以平均值±標準差表示。

2.3.2抗氧化活性分析

實驗中細胞菌懸液經細胞破碎儀處理，菌株的破碎率達100%。4株乳酸菌的抗氧化活性測定結果如圖4，菌株對DPPH自由基和羥自由基均有不同程度的清除作用，且菌懸液的抗氧化能力高于無細胞提取物。菌株MRSA1和MRSA2的DPPH自由基清除能力顯著高于其他2株菌(P<0.05)，完整細胞菌懸液的清除能力顯著高于無細胞提取液(P<0.01)，因此初步推測乳酸菌清除DPPH自由基的活性物質主要存在于細胞表面。不同菌株之間羥自由基清除能力無顯著性差異(P>0.05)。

氧化作用是生物體內重要的生理過程，在此過程中會產生自由基，當自由基超過一定量時，就會對機體造成損傷[21]。乳酸菌的抗氧化活性已經通過體內和體外實驗證明，含有乳酸菌的功能性食品也越來越受到青睞[22]。不同乳酸菌的抗氧化能力存在差異，可能是由于菌株分泌的抗氧化活性物質種類和含量不同引起的[23]。劉宏宇等[24]研究了25株不同乳酸菌的抗氧化活性，發(fā)現腸膜明串珠菌的DPPH自由基清除能力最高可達30.73%，本研究的乳明串珠菌DPPH自由基清除能力高達60.67%。

DPPH-1、Hydroxyl-1表示細胞破碎前菌懸液，DPPH-2、Hydroxyl-2表示無細胞提取液。圖4 菌株對DPPH自由基和羥自由基的清除率Fig.4 DPPH and hydroxyl radical scavenging activities of selected strains

3 結 論

從4種市售宮廷奶酪中分離并經初篩和復篩得到4株乳酸菌，其中菌株MRSA1和MRSB1鑒定為屎腸球菌，MRSA2和MRSD3為乳明串珠菌。抑菌實驗結果表明，此4株乳酸菌均有抑菌活性，其中MRSA2對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、阪琦桿菌和志賀氏菌有較強抑制作用；而將發(fā)酵液pH值調至中性后，抑菌效果消失，推測抑菌活性物質為酸性物質?？寡趸钚詫嶒灲Y果表明，4株菌均對DPPH自由基和羥自由基具有清除能力，菌懸液的自由基清除率顯著高于無細胞提取液。菌株MRSA1和MRSA2的DPPH自由基清除能力分別高達55.04%和60.67%，4株菌的羥自由基清除能力無明顯區(qū)別。本研究篩選的具有良好抑菌特性、抗氧化活性和產酸能力的乳明串珠菌在功能性發(fā)酵食品中有潛在的應用前景。