汪 飛， 吳 敬， 陳 晟

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/教育部食品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無(wú)錫 214122)

β-葡萄糖苷酶廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中[1]，其微生物來(lái)源包括原核微生物約氏黃桿菌、真核微生物清酒酵母、黑曲霉等[2]。β-葡萄糖苷酶能水解β-D-糖苷鍵和配基[3]，同時(shí)也具有轉(zhuǎn)糖苷活性，可以將水解釋放出的配基或葡萄糖體以β-1,6-糖苷鍵形式轉(zhuǎn)移到其他糖底物上[4]。

低聚龍膽糖是一種功能性低聚糖，包括龍膽二糖，少量的三糖和四糖[5]。低聚龍膽糖不能被人體降解，并且熱量低，適合肥胖癥、糖尿病等人群食用[6]。同時(shí)低聚龍膽糖作為功能性低聚糖可以有效地改善腸內(nèi)菌群[7]，目前已被廣泛地運(yùn)用于食品行業(yè)中。

早期多利用提取法制備低聚龍膽糖；但提取法受原料的限制，且過(guò)程復(fù)雜，效率低，難以工業(yè)化生產(chǎn)[8]。酶轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。工業(yè)上主要通過(guò)β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化合成低聚龍膽糖，即通過(guò)游離酶或固定化酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為低聚龍膽糖，再經(jīng)分離純化精制獲得不同規(guī)格的低聚龍膽糖成品[9-10]。相比于游離酶，固定化酶具有重復(fù)使用、產(chǎn)物易分離、穩(wěn)定性高、可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11]。目前只有日本食品化工株式會(huì)社實(shí)現(xiàn)了低聚龍膽糖工業(yè)化生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道[12]。

本研究擬在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)已構(gòu)建好的重組菌P.pastorisKM71/pPIC9K-bgl1/pPICZ A-pdi3.6 L罐發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行固定化研究并將其應(yīng)用到低聚龍膽糖的生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌株與質(zhì)粒

重組菌P.pastorisKM71/pPIC9K-bgl1/pPICZ A-pdi由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，以P.pastorisKM71為宿主，整合來(lái)自綠色木霉(Trichodermaviride)的β-葡萄糖苷酶基因bgl1，同時(shí)共表達(dá)二硫鍵異構(gòu)酶pdi(提高新生肽的折疊效率)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

對(duì)- 硝基苯基-β-葡萄糖苷(pNPG)，上海西寶公司；龍膽二糖、龍膽三糖，美國(guó)Sigma公司；其他常見(jiàn)試劑，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3儀器與設(shè)備

Agilent 1200型HPLC色譜儀、Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent示差折光檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司。

1.1.4培養(yǎng)基的配制

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10.0，胰蛋白胨20.0，YNB 13.4，甘油30.0。

BSM培養(yǎng)基(g/L)：CaSO4·2H2O 0.939，MgSO4·7H2O 14.9，KOH 4.13，K2SO418.2，甘油 30.0；85% H3PO426.7 mL/L，PTM微量元素溶液4.32 mL/L。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：50 g/L甘油，同時(shí)加入PTM微量元素溶液5 mL/L。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：體積分?jǐn)?shù)100%甲醇，同時(shí)加入PTM微量元素溶液12 mL/L。

PTM微量元素溶液(g/L)：FeSO4·7H2O 65，MnSO4·H2O 3，CuSO4·5H2O 6，ZnCl220，CoCl20.5，Na2MoO3·2H2O 0.2，KI 0.08，H2SO45.0，H3BO30.02，生物素0.2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵條件優(yōu)化

從甘油管中吸取200 μL的種子液接種到100 mL發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，然后接種到含有1 L BSM培養(yǎng)基的3.6 L發(fā)酵罐中。發(fā)酵的條件為溫度30 ℃，溶氧30%，pH值5.0。當(dāng)出現(xiàn)溶氧反彈時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)加甘油，控制菌體濃度每小時(shí)增加3 g/L，到達(dá)預(yù)設(shè)的初始誘導(dǎo)菌體濃度時(shí)停止補(bǔ)加甘油，將菌體饑餓2 h，然后添加一定體積分?jǐn)?shù)的甲醇開(kāi)始促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，通過(guò)甲醇濃度檢測(cè)流加儀將甲醇體積分?jǐn)?shù)一直維持在預(yù)設(shè)的數(shù)值。主要從誘導(dǎo)溫度(25、28、30 ℃)，初始誘導(dǎo)菌體濃度(33、50、60 g/L)，甲醇體積分?jǐn)?shù)(0.5%、1.0%、1.5%)3個(gè)方面優(yōu)化重組P.pastoris在3.6 L發(fā)酵罐中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵條件。

1.2.2酵母菌體濃度的測(cè)定

取一定量的菌液，用去離子水稀釋一定的倍數(shù)，在600 nm波長(zhǎng)處用分光光度計(jì)檢測(cè)對(duì)應(yīng)的吸光度，菌體濃度(g/mL)計(jì)算見(jiàn)式(1)，測(cè)定之前先用去離子水進(jìn)行校零。發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間的OD600可表示此時(shí)菌體的生長(zhǎng)狀況。

菌體濃度=稀釋倍數(shù)×OD600×0.3。

(1)

1.2.3固定化酶及固定化條件優(yōu)化

殼聚糖微球載體的制備：將一定質(zhì)量的殼聚糖溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的醋酸溶液中，制成殼聚糖膠體溶液。用帶針頭的注射器將上述膠體溶液以60滴/min的速度滴入4 mol/L氫氧化鈉溶液中，形成大小均一的殼聚糖微球,然后用去離子水洗至中性。將制好的殼聚糖微球加入到一定質(zhì)量濃度的戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)，4 ℃條件下靜置2 h后用去離子洗去多余的戊二醛溶液，殼聚糖微球載體4 ℃條件下保存于去離子水中備用。

β-葡萄糖苷酶的固定化：稱(chēng)取5.0 g殼聚糖微球載體，加入10 mL含一定單位酶活力的醋酸緩沖液(50 mmol/L，pH值 5.0)，于4 ℃振蕩吸附交聯(lián)一定時(shí)間后取出抽濾，用蒸餾水洗去未交聯(lián)游離酶，即得到固定化酶。

采用單因素實(shí)驗(yàn)，控制一個(gè)因素不變，分別改變微球載體的殼聚糖和戊二醛含量、加酶量和吸附時(shí)間來(lái)考察各個(gè)因素對(duì)固定化效果的影響。

1.2.4固定化酶操作穩(wěn)定性分析

將固定化微球在酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)中重復(fù)使用多次，檢測(cè)每批反應(yīng)中低聚龍膽糖的產(chǎn)率。

1.2.5β-葡萄糖苷酶酶活力的測(cè)定

pNPG法測(cè)定β-葡萄糖苷酶水解活力。反應(yīng)的總體系為1 mL，取960 μL pH值5.0的醋酸緩沖液加入到5 mL離心管中，加入20 μL適當(dāng)稀釋的酶液，在60 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，然后加入20 μL同樣經(jīng)過(guò)預(yù)熱的100 mmol/L的pNPG，精確反應(yīng)10 min，200 μL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，室溫下靜置顯色5 min，于405 nm下測(cè)定吸光度，對(duì)照組中加入失活的酶[13]。

β-葡萄糖苷酶酶活力單位定義：每分鐘生成1 μmol 對(duì)硝基苯酚所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

固定化酶酶活力的測(cè)定只需要將20 μL適當(dāng)稀釋的酶用一定質(zhì)量的固定化酶代替，其他步驟相同。固定化酶酶活回收率計(jì)算見(jiàn)式(2)。

(2)

1.2.6酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的測(cè)定

酶轉(zhuǎn)化生成的低聚龍膽糖，以及反應(yīng)體系中的葡萄糖、纖維二糖均通過(guò)HPLC進(jìn)行檢測(cè)。HPLC條件：Agilent ZORBAX NH2 色譜柱(4.6 m×250 mm)，柱溫35 ℃；參比池溫度40 ℃；流動(dòng)相為乙腈和去離子水的混合溶液(體積比75∶25)；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組畢赤酵母發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

以前期構(gòu)建好的重組菌P.pastorisKM71/pPIC9K-bgl1/pPICZ A-pdi為出發(fā)菌株，在3.6 L罐上進(jìn)行放大培養(yǎng)，分別從誘導(dǎo)溫度、初始誘導(dǎo)菌體濃度和誘導(dǎo)階段甲醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)方面對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)Trichodermavirideβ-葡萄糖苷酶在重組畢赤酵母中的高效表達(dá)。

2.1.1誘導(dǎo)溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

大量的研究表明在畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)階段誘導(dǎo)溫度是影響菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的重要因素，而且不同的重組菌往往有不同的最適誘導(dǎo)溫度[14-15]。研究擬定在25、28、30 ℃ 3個(gè)誘導(dǎo)溫度條件下考察誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。設(shè)定初始誘導(dǎo)菌體濃度為33 g/L，甲醇體積分?jǐn)?shù)1.0%，誘導(dǎo)144 h后結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵上清液β-葡萄糖苷酶酶活力如圖1。β-葡萄糖苷酶酶活力隨溫度的降低而提高，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時(shí)，β-葡萄糖苷酶酶活力最高為916 U/mL，分別為28 ℃和25 ℃條件下最高酶活力的81.9%和73.7%；誘導(dǎo)溫度為28 ℃和25 ℃時(shí)，β-葡萄糖苷酶的酶活力相當(dāng)?？紤]到工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中制冷成本較大，所以選取28 ℃作為誘導(dǎo)溫度。

圖1 誘導(dǎo)溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活力的影響Fig.1 Effect of induction temperatures on β-glucosidase activity

2.1.2初始誘導(dǎo)菌體濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

初始誘導(dǎo)菌體濃度對(duì)重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)酶有很大影響，在低菌體濃度下進(jìn)行誘導(dǎo)，菌體對(duì)環(huán)境較為敏感，不利于生長(zhǎng)，導(dǎo)致最終的菌體濃度較低，從而最終的酶活力也會(huì)很低；在高菌體濃度下進(jìn)行誘導(dǎo)，最終的菌體濃度也會(huì)很高。但當(dāng)菌體量達(dá)到一定程度時(shí)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧就不能滿足菌體的需求，導(dǎo)致發(fā)酵后期菌體的生長(zhǎng)環(huán)境較為惡劣，菌體會(huì)釋放出一些蛋白酶，從而影響目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[16-17]。為了提高β-葡萄糖苷酶的表達(dá)量同時(shí)保證發(fā)酵后期酵母細(xì)胞的活力，研究對(duì)初始誘導(dǎo)菌體濃度進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)菌體濃度分別達(dá)到33、50、60 g/L時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)階段甲醇體積分?jǐn)?shù)維持在1.0%，28 ℃誘導(dǎo)144 h后結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵上清液β-葡萄糖苷酶酶活力如圖2。當(dāng)初始誘導(dǎo)菌體濃度為50 g/L時(shí)，β-葡萄糖苷酶酶活力最高，能達(dá)到1 452 U/mL，分別是菌體濃度達(dá)到33、60 g/L條件下的1.3、1.2倍。因此確定初始誘導(dǎo)菌體濃度為50 g/L時(shí)較優(yōu)。

圖2 初始誘導(dǎo)菌體濃度對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活力的影響Fig.2 Effect of initial cell densities on β-glucosidase activity

2.1.3誘導(dǎo)階段甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在畢赤酵母誘導(dǎo)階段，甲醇作為碳源的同時(shí)也是誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)酵母細(xì)胞產(chǎn)生醇氧化酶并利用甲醇為酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)酶提供能量，同時(shí)誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。因此控制誘導(dǎo)過(guò)程中甲醇體積分?jǐn)?shù)是畢赤酵母進(jìn)行高密度發(fā)酵的關(guān)鍵一步[17]。為了研究誘導(dǎo)過(guò)程中甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，在初始菌體濃度50 g/L，誘導(dǎo)溫度為28 ℃條件下，分別采用0.5%、1.0%、1.5% 3個(gè)不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，菌體產(chǎn)酶情況如圖3。當(dāng)培養(yǎng)基中甲醇體積分?jǐn)?shù)維持在1.0%時(shí)，β-葡萄糖苷酶酶活力最高，為1 452 U/mL，分別是0.5%、1.5%條件下的1.2、1.4倍，從而確定誘導(dǎo)階段較優(yōu)甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.0%。發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳如圖4。

圖3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活力的影響Fig.3 Effect of methanol concentrations on β-glucosidase activity

圖4 重組P. pastoris 3.6 L罐發(fā)酵 上清液SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of 3.6 L fermentor culture supernatant of recombined P. pastoris

2.2 β-葡萄糖苷酶固定化條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1殼聚糖含量對(duì)固定化酶的影響

殼聚糖含量影響固定化微球的機(jī)械強(qiáng)度、比活、底物傳質(zhì)速度等，從而影響固定化酶的酶活回收率。在戊二醛質(zhì)量濃度為0.010 g/mL、加酶量為400 U/g、吸附時(shí)間為12 h的條件下研究了不同殼聚糖含量對(duì)固定化β-葡萄糖苷酶酶活回收率的影響，結(jié)果如圖5。酶活回收率隨著殼聚糖含量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度為0.03 g/mL時(shí)，酶活回收率達(dá)到最大值為53.6%。當(dāng)殼聚糖含量過(guò)低時(shí)，微球載體的機(jī)械強(qiáng)度低，在吸附和沖洗過(guò)程中易破裂；但當(dāng)殼聚糖含量過(guò)高時(shí)，微球載體的空隙很小，影響酶進(jìn)入載體內(nèi)部，底物傳質(zhì)也困難，從而影響酶活回收率[19]。因此，選用0.03 g/mL的殼聚糖來(lái)制備微球載體。

圖5 殼聚糖含量對(duì)固定化酶酶活回收率的影響Fig.5 Effect of chitosan concentrations on recovery of immobilized enzyme

2.2.2戊二醛含量對(duì)固定化酶的影響

戊二醛是殼聚糖微球載體制備過(guò)程中的交聯(lián)劑，可以使線性的殼聚糖分子轉(zhuǎn)變成網(wǎng)狀高聚物，生成交聯(lián)殼聚糖[20-21]。當(dāng)戊二醛含量過(guò)低時(shí)，殼聚糖微球載體的機(jī)械強(qiáng)度差，固定化的酶易脫落；戊二醛含量過(guò)高時(shí)，戊二醛會(huì)發(fā)生羥醛縮合，固化成不規(guī)則物附在微球載體表面，從而影響微球載體表面的孔結(jié)構(gòu)，使酶不易被固定，而且還會(huì)使得共價(jià)連接后的酶與酶之間過(guò)于緊密，改變酶的構(gòu)象，從而影響固定化酶的酶活回收率[22]。在殼聚糖質(zhì)量濃度為0.03 g/mL、加酶量為400 U/g、吸附時(shí)間為12 h的條件下研究了戊二醛含量對(duì)固定化β-葡萄糖苷酶酶活回收率的影響，結(jié)果如圖6。當(dāng)戊二醛質(zhì)量濃度為0.008 g/mL時(shí)，酶活回收率達(dá)到最大，為56.5%。因此，選擇0.008 g/mL的戊二醛作為交聯(lián)劑。

圖6 戊二醛含量對(duì)固定化酶酶活回收率的影響Fig.6 Effect of glutaraldehyde concentrations on recovery of immobilized enzyme

2.2.3游離酶添加量對(duì)固定化酶的影響

在殼聚糖質(zhì)量濃度為0.03 g/mL、戊二醛質(zhì)量濃度為0.008 g/mL、吸附時(shí)間為12 h的條件下研究了不同游離酶添加量對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活回收率的影響，結(jié)果如圖7。當(dāng)加酶量為400 U/g時(shí)，固定化酶酶活力達(dá)到最大為226 U/g，繼續(xù)增加酶添加量而固定化酶的活力增加不顯著。當(dāng)微球載體吸附游離酶未達(dá)到飽和時(shí)，固定化酶的酶活力隨著游離酶添加量的增大而增大；但當(dāng)微球載體達(dá)到飽和時(shí)，繼續(xù)增加游離酶添加量，固定化酶的酶活力不會(huì)再增加，酶活回收率反而逐漸降低。所以從固定化酶的酶活力和酶活回收率兩個(gè)方面綜合考慮，游離酶的添加量為400 U/g較為合適。

圖7 游離酶添加量對(duì)固定化酶酶活 回收率和酶活力的影響Fig.7 Effect of free enzyme concentrations on recovery and activity of immobilized enzyme

2.2.4吸附時(shí)間對(duì)固定化酶的影響

在殼聚糖質(zhì)量濃度為0.03 g/mL、戊二醛質(zhì)量濃度為0.008 g/mL、加酶量為400 U/g的條件下，研究了吸附時(shí)間對(duì)固定化β-葡萄糖苷酶酶活回收率的影響，結(jié)果如圖8。當(dāng)固定化時(shí)間達(dá)到20 h后，載體與酶的作用達(dá)到飽和，此時(shí)酶活回收率達(dá)到65.4%，酶活為261.6 U/g，因此選擇的吸附時(shí)間為20 h較為合適。

圖8 吸附時(shí)間對(duì)固定化酶酶活回收率的影響Fig.8 Effect of adsorbtion time on recovery of immobilized enzyme

2.3 固定化酶操作穩(wěn)定性研究

固定化酶跟游離酶相比，有較好的操作穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。將固定化酶連續(xù)酶轉(zhuǎn)化6次，每次結(jié)束后檢測(cè)低聚龍膽糖的產(chǎn)率。酶轉(zhuǎn)化在pH值5.0，60 ℃條件下進(jìn)行，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%葡萄糖和40%纖維二糖為底物，加酶量為400 U/g(1 g纖維二糖的加酶量為400 U)，反應(yīng)48 h后終止反應(yīng)，結(jié)果如圖9。隨著轉(zhuǎn)化次數(shù)的增加，低聚龍膽糖的產(chǎn)率逐漸下降；連續(xù)轉(zhuǎn)化第6次時(shí)，低聚龍膽糖產(chǎn)率仍有15.2%，顯示出該固定化酶具有較好的持續(xù)利用性及較高的低聚龍膽糖生產(chǎn)能力。

圖9 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.9 Operational stability of immobilized enzyme

3 結(jié) 論

研究對(duì)重組菌P.pastorisKM71/pPIC9K-bgl1/pPICZ A-pdi進(jìn)行3.6 L罐放大培養(yǎng)，分別從誘導(dǎo)溫度、初始誘導(dǎo)菌體濃度和誘導(dǎo)階段甲醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)方面對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)誘導(dǎo)溫度28 ℃，初始誘導(dǎo)菌體濃度50 g/L，誘導(dǎo)階段甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，酶活力最高，能達(dá)到1 452 U/mL。同時(shí)以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，采用吸附交聯(lián)法對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行固定化。結(jié)果表明，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度為0.03 g/mL，戊二醛質(zhì)量濃度為0.008 g/mL，游離酶加量為400 U/g，固定化吸附時(shí)間為20 h時(shí)，固定化酶酶活回收率最高達(dá)到65.4%。在優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件下連續(xù)轉(zhuǎn)化6次，低聚龍膽糖產(chǎn)率仍有15.2%，顯示出該固定化酶具有較好的持續(xù)利用性及較高的低聚龍膽糖的生產(chǎn)能力，為固定化酶法合成低聚龍膽糖的工業(yè)化提供了一定的參考價(jià)值。