楊 穎，王愛娜

(渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714026)

褐飛虱(Nilaparvata lugens Stal)，半翅目飛虱科屬，是農(nóng)作物水稻最具破壞性的農(nóng)業(yè)害蟲，主要通過直接吸食水稻韌皮部汁液傳播水稻草狀矮化病毒［1］，目前防控飛虱的主要措施仍以化學(xué)防治為主［2］，盡管利用殺蟲劑較為便捷，但也存在廣泛使用造成環(huán)境污染，飛虱抗藥性的產(chǎn)生，由于其非選擇性的滅殺對一些有益生物也是有害的，例如傳粉昆蟲和自然天敵［3］，而不加選擇性的使用殺蟲劑尤其是在作物早期，也會引起刺吸式害蟲的大爆發(fā)［4］。因此，選擇抗性靶基因，采取新的防治手段，對褐飛虱治理具有重要意義。

RNA 干擾(RNA interferenee，RNAi)作為一種重要基因沉默機(jī)制，可通過dsRNA 的介導(dǎo)，高效特異性降解目的基因的mRNA，抑制(Knockdown)目的基因的表達(dá)。目前利用RNAi 技術(shù)對于昆蟲的研究，主要利用注射或飼喂的方法，將dsRNA 或siRNA 導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞或活體昆蟲體內(nèi)從而實(shí)施干擾［5］，通過檢測靶基因的沉默效率或相應(yīng)生物表型分析從而研究相應(yīng)基因功能，為進(jìn)一步篩選出可有效防控害蟲的基因資源提供了保障。孟山都公司Baum 等研究發(fā)現(xiàn)，利用表達(dá)玉米根葉甲VATPase 基因dsRNA 的轉(zhuǎn)基因玉米，飼喂玉米根葉甲幼蟲，幼蟲出現(xiàn)發(fā)育受阻或死亡現(xiàn)象［6］。

V-ATPases 是一類ATP 驅(qū)動的質(zhì)子泵，存在于真核生物細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞器內(nèi)膜上，通過ATP水解產(chǎn)生的能量，將H +泵出包膜形成跨膜質(zhì)子梯度，維持細(xì)胞正常生理活動，在胞內(nèi)外pH 環(huán)境，離子和代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要作用［7，8］。此外V-ATPases 是由多個亞基構(gòu)成的功能性復(fù)合物，該復(fù)合體包括V1 和V0 兩大結(jié)構(gòu)域，位于外周的V1 由8 個亞基組成，負(fù)責(zé)催化ATP 水解，跨膜的V0 結(jié)構(gòu)域由6 個亞基組成，負(fù)責(zé)質(zhì)子轉(zhuǎn)移［9，10］。為利用RNAi 技術(shù)進(jìn)行褐飛虱防治，本研究將褐飛虱V-ATPase D 亞基基因片段和VATPase H 亞基基因片段進(jìn)行融合，獲得約800 bp的V-ATPase D-H (VAD-H)融合基因，其以反向重復(fù)方式連入經(jīng)改造含有Pdk 內(nèi)含子的中間載體pUCm-T。通過重組PCR 將上述兩種基因融合后構(gòu)建具有反向重復(fù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi 表達(dá)載體，旨在為利用RNAi 技術(shù)培育雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻新種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 本試驗(yàn)飼養(yǎng)飛虱所用水稻材料為日本晴水稻，褐飛虱由本校植物抗逆研究中心提供，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)(溫度25 ±2 ℃，相對濕度70%～80%，15 h 光照/9 h 黑暗)利用水稻幼苗進(jìn)行飼養(yǎng)繁育。后續(xù)生測實(shí)驗(yàn)中，選取同齡期幼蟲并分成3 組每組20 只左右。

1.1.2 主要試劑 試驗(yàn)所用大腸桿菌(Escherichia.coli)菌株DH5α，載體pUCm-T 均由本實(shí)驗(yàn)室保存和提供。引物由擎科生物合成，RNA 抽提試劑Trizol 購自Invitrogen 公司，MEGAscriptTM T7 Transcription Kit (ambion，AM1334)轉(zhuǎn)錄試劑盒購自ThermoFisher scientific 公司，Ex Taq、內(nèi)切酶和T4 ligase 購自Takara 公司，cDNA 合成和qPCR 試劑盒均購自全式金公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 V-ATPase D-V-ATPase H(VAD-H)融合基因的獲取 利用半翅目點(diǎn)蜂緣蝽(Riptortus pedestris)的vacuolar H+ATPase subunit 氨基酸序列(Genebank:BAN20615)，作為探針在褐飛虱數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行tBlastn 檢索，發(fā)現(xiàn)褐飛虱的V-ATPase H 亞基基因序列(GenBank:XM _022328393.1)，根據(jù)該基因不同轉(zhuǎn)錄本選其共有序列，以及褐飛虱V-ATPase D (GenBank:XM_022330230)基因的保守序列分別設(shè)計特異性擴(kuò)增引物(表1)，采用重組PCR 擴(kuò)增獲取V-ATPase D-V-ATPase H(簡稱VAD-H)的融合基因。以3 齡飛虱若蟲cDNA 為模板，VAD-H-α-F1 和VAD-H-α-R1 為引物，擴(kuò)增獲取V-ATPase D 亞基的基因片段;以VAD-H-F2 和VAD-H-R2 為引物，擴(kuò)增獲取V-ATPase H 亞基基因片段，再以PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物V-ATPase D 和V-ATPase H 亞基基因?yàn)槟０澹琕AD-H-F1 和VAD-H-R2 為引物進(jìn)行重組PCR，擴(kuò)增VADH 融合基因。

圖1 hp(VAD-H)結(jié)構(gòu)示意

PCR 反應(yīng)體系:2 ×Prime STAR Buffer (Mg2+Plus)12.5 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，Prime STAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μl)0.5 μl，10 μmol·L-1上游引物0.5 μl，10 μmol·L-1下游引物0.5 μl，模板0.5 μl，加ddH2O 至25 μl。PCR 反應(yīng):98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸50 s，30 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收并純化后，將融合基因片段連入pMD19-T 載體，得T-VAD-H 并測序驗(yàn)證。

表1 引物序列

1.2.2 dsRNA 的體外合成 上述獲得的VAD-H 融合基因，在擴(kuò)增該序列所設(shè)計的特異性引物VAD-H-F1、R2 的5'端分別加上T7 啟動子序列(TAATACGACTCACTATAGGG)，以及添加T7 啟動子序列的dsGFP F 和dsGFP R(表1)，利用試劑盒MEGAscript T7 Kit (ambion，AM1334)在體外分別進(jìn)行干擾片段VAD-H 的dsRNA 和dsGFP 合成。

1.2.3 體外飼喂dsRNA 通過體外飼喂法進(jìn)行飛虱RNAi 研究，選TN1 水稻幼苗上的3 齡褐飛虱生測，體外實(shí)驗(yàn)所用飛虱先經(jīng)過2 d 人工飼料(未加dsRNA)喂食適應(yīng)再進(jìn)行dsRNA 飼喂。喂食含400 ng·μL-1ds-VAD-H 的人工飼料為試驗(yàn)組，添加400 ng·μL-1dsGFP 的作為對照組，每天按時更換人工飼料。褐飛虱飼喂采用雙通玻璃管，其一端用parafilm 膜密封，另一端采用雙層parafilm 膜中間添加人工飼料而成，管內(nèi)接入生長發(fā)育一致的3 齡待測褐飛虱，每管接入30 頭，重復(fù)3 次，每天記錄飛虱存活率和生長發(fā)育情況。實(shí)驗(yàn)在人工氣候室中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)條件:溫度27 ±1℃，濕度75 ±5%，光照周期為16 h 光照，8 h 黑暗。

1.2.4 實(shí)時定量RT-PCR 分析檢測 用Trizol提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript One-step cDNA Synthesis SuperMix)合成cDNA。將合成的第一鏈cDNA 稀釋10 倍后作為模板，進(jìn)行定量檢測，所用引物為如表2 所示。qPCR 反應(yīng)體系為20 μL:2 ×TransStart Tip Green qPCR Super-Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，cDNA模板(20 ng·μL-1)1 μL，ddH2O 8.2 μL。qPCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃30 s;94℃5 s，60℃30 s，40 個循環(huán)。Real-Time qPCR 所用的儀器為ABI Prism 7300，選用揭飛虱β-actin 基因(GenBank:EUl79846)作為內(nèi)參，基因相對表迖量計算采用Livak 和Schmittgen［11］的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組PCR 擴(kuò)增獲取VAD-H 融合基因

以3 齡飛虱若蟲cDNA 為模板，VAD-H-F1 和VAD-H-R1 為引物，擴(kuò)增獲取了約400 bp 的V-ATPase D 亞基基因片段。以VAD-H-F2 和VAD-H-R2 為引物，擴(kuò)增獲取400 bp的V-ATPase H 亞基基因片段。再以PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物V-ATPase D 和V-ATPase H 亞基基因?yàn)槟０澹琕AD-H-F1 和VAD-H-R2 為引物進(jìn)行重組PCR，擴(kuò)增獲得約800 bp 的VAD-H 融合基因片段(圖2)。將融合基因片段連入pMD19-T載體，經(jīng)測序驗(yàn)證，所得序列為基因重組序列(圖2)。

圖2 VAD-H 融合基因片段的PCR 擴(kuò)增

2.2 pUCm-hp(VAD-H)重組載體構(gòu)建

為獲取發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi 載體，利用經(jīng)改造含有Pdk 內(nèi)含子的中間載體pUCm-T 構(gòu)建干擾片段的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。采用限制性內(nèi)切酶Sac I 和Kpn I 對T-VAD-H 質(zhì)粒進(jìn)行酶切，獲得大小為800 bp 的融合基因片段VAD-H，酶切片段回收后連入經(jīng)Sac I/Kpn I 酶切的pUCm-T 載體，獲得pUCm-T-VAD-H-Intron 重組載體。再用Sal I 和Xho I 對重組載體T-VAD-H 進(jìn)行酶切，酶切片段回收后連入經(jīng)Sal I/Xho I 酶切的重組載體pUCm-T-VAD-H-Intron，獲取含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pUCm-hp(VAD-H)重組載體(圖3)。

圖3 pUCm-hp(VAD-H)載體結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 體外喂食dsRNA 后褐飛虱的存活率

選取生長發(fā)育一致的3 齡飛虱若蟲，用人工飼料飼喂2 d 后再用于dsRNA 飼喂試驗(yàn)，持續(xù)8 d后各處理存活的若蟲均羽化變?yōu)槌上x。測試用融合基因VAD-H 的dsRNA 通過體外合成，添加到人工飼料中濃度為0.4 μg·μl-1，與對照組進(jìn)行比較，從第2 天開始處理組飛虱存活率便出現(xiàn)降低，當(dāng)飼喂至第8 天時VAD-H 干擾組存活率僅為48.3%，并且VAD-H 干擾組與對照組差異顯著(圖4)

圖4 飼喂dsRNA 后褐飛虱的存活率

2.4 體外喂食dsRNA 后對飛虱靶基因影響

為檢測飛虱取食dsRNA 后對其體內(nèi)靶標(biāo)基因mRNA 的影響，利用熒光定量PCR 對靶基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)所用飛虱為上述喂食添加dsGFP 的對照組和添加dsRNA 試驗(yàn)組，4 到8天后選取生長發(fā)育一致的褐飛虱，分別抽提RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，用qRT-PCR 檢測褐飛虱體內(nèi)靶基因的相對表達(dá)量。

持續(xù)飼喂dsRNA 4 d、6 d 至8 d 后，褐飛風(fēng)體內(nèi)靶標(biāo)mRNA 水平均發(fā)生不同程度的降低，降低水平隨著飼喂時間的延長而升高。如圖5 靶基因的轉(zhuǎn)錄水平從第4 天開始降低，飼喂至第八天飛虱靶基因V-ATPase D 轉(zhuǎn)錄水平降低了47.6%，靶基因V-ATPase H 的轉(zhuǎn)錄水平降低了29.7%(圖5)。

圖5 飼喂dsRNA 后褐飛虱靶基因表達(dá)量(*，P ＜0.05;＊＊，P ＜0.01.)

3 討論

目前利用RNAi 進(jìn)行昆蟲功能基因的研究主要通過注射法和飼喂法。Liu 等利用顯微注射向褐飛虱體內(nèi)注射組成型表達(dá)的鈣網(wǎng)蛋白(Calr)和腸道特異蛋白(Ctsb)基因的dsRNA［12］，注射后第4 天兩種基因表達(dá)水平均降低了40%左右。Chen等利用添加靶基因海藻糖磷酸合酶(NlTPS)dsRNA 的人工飼料飼喂褐飛虱［13］，使該基因在mRNA 水平和酶活性顯著降低，此外隨著飼喂時間延長褐飛虱發(fā)育水平也受到影響，甚至出現(xiàn)死亡。上述研究表明dsRNA 進(jìn)入褐飛虱體內(nèi)后能夠特異性地沉默相關(guān)靶基因，由于注射法對飛虱、蚜蟲等體型較小的昆蟲易造成機(jī)械損傷，死亡率較高，因此本實(shí)驗(yàn)采用人工飼料喂食法。

筆者研究將褐飛虱V-ATPase D 亞基基因片段和V-ATPase H 亞基基因片段進(jìn)行融合，獲得約800 bp 的融合基因，構(gòu)建針對該融合基因的RNAi 干擾載體。相比于之前有關(guān)RNAi 抗蟲研究，只針對單個目的基因，本實(shí)驗(yàn)通過基因融合形成新的干擾基因片段，同時構(gòu)建了雙價干擾載體。褐飛虱取食添加有融合基因VAD-H dsRNA 的人工飼料，飼喂8 天后褐飛虱死亡率為51.7%，與對照相比差異顯著(圖3)，此外我們對取食dsRNA的褐飛虱靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)量與對照相比顯著下降(圖5)，表明攝入體外表達(dá)的融合基因dsRNA，能夠引發(fā)褐飛虱體內(nèi)RNAi 效應(yīng)。

由于人工飼料飼喂時添加dsRNA 的濃度與蟲體RNAi 呈劑量效應(yīng)，因此當(dāng)外界不能持續(xù)提供dsRNA 時，干擾效果會受到限制。因此本研究后面將通過構(gòu)建RNAi 植物表達(dá)載體，獲取體外穩(wěn)定表達(dá)dsRNA 的植株，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植物抗飛虱方面作用。