王瑋彤，趙雪松

(吉林師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 四平 136000)

0 引言

阻燃劑被廣泛應(yīng)用在電子、電器、化工、交通、建材、紡織品、石油、采礦等領(lǐng)域，成為僅次于增塑劑的材料助劑[1]。以多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated diphenyl ethers， PBDEs)為代表的溴代阻燃劑因其性能優(yōu)越及價(jià)格低廉，曾成為最重要的有機(jī)阻燃劑[2]，但由于其在環(huán)境中具有持久性、生物富集性和生態(tài)毒性，歐盟、美國、加拿大和中國等相繼發(fā)布系列政策限制或禁止PBDEs的使用。而有機(jī)磷阻燃劑(Organophosphorus flame retardants， OPFRs)因能滿足新型阻燃劑高效、低煙、低毒、多功能的要求，產(chǎn)量和使用量逐年增加，現(xiàn)成為當(dāng)今阻燃劑研究的熱點(diǎn)[3]。磷酸三(1，3-二氯二丙基)酯(TDCPP)是一種典型的有機(jī)磷阻燃劑，廣泛應(yīng)用于建材、紡織、化工以及電子等行業(yè)[4]。由于TDCPP屬于添加劑，以非化學(xué)鍵方式添加到產(chǎn)品中，導(dǎo)致其易于擴(kuò)散到周圍環(huán)境中[5]，因此它雖作為溴代阻燃劑的替代品，但是也屬于環(huán)境中廣泛存在的新興持久性有機(jī)污染物。環(huán)境監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)顯示，目前全球室內(nèi)和室外空氣、地表和地下水、沉積物和生物群TDCPP的檢測(cè)率極高。例如：美國加利福尼亞地區(qū)室內(nèi)灰塵中TDCPP的濃度為2 100 g/g[6]；Green等研究發(fā)現(xiàn)挪威垃圾填埋場(chǎng)與機(jī)動(dòng)車銷毀處沉積物中OPFRs濃度較高，分別為746 000～1 790 000 g/kg與27 700～33 800 g/kg，其中TDCPP的濃度分別為250～8 800 g/kg與1 500～4 100 g/kg[7]；Chen等研究發(fā)現(xiàn)，挪威沿海地區(qū)黑背鷗和銀鷗的鳥蛋中TDCPP濃度分別達(dá)到1.9 ng/g與0.17 ng/g[8]；我國廈門與青島附近海域TDCPP的濃度范圍為24.1～377 ng/L[9]；珠江中草魚(Clariusfuscus)與鯰魚(Cyprinusidellus)體內(nèi)TDCPP的濃度均達(dá)到了251 ng/g(濕重)[10]。

斑馬魚(zebrafish， danio rerio)，又名藍(lán)條魚，體長約4～5 cm，體呈紡錘形，其體側(cè)斑紋酷似斑馬。近年來，斑馬魚作為一種非常好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，被越來越多的?yīng)用到毒性測(cè)試和獨(dú)立研究中。美國環(huán)境保護(hù)署(USEPA ECOTOX Database，2000)和經(jīng)濟(jì)合作發(fā)展組織(OECD，1998)曾將斑馬魚列為研究內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)對(duì)脊椎動(dòng)物影響的模式生物之一。本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚胚胎作為受試生物，觀察TDCPP暴露對(duì)水生生物急性發(fā)育毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

TDCPP，純度>99.9%，購自Sigma公司。二甲基亞楓(DMSO)購自Sigma公司。儲(chǔ)備液配置方法：取1 g/L TDCPP 1 mL和DMSO 9 mL混合均勻，即把1 g/L TDCPP溶液稀釋為100 mg/L TDCPP儲(chǔ)備液。稀釋液為經(jīng)過珊瑚砂、陶粒、活性炭和濾棉過濾滅菌超過24 h的自來水。用移液槍分別取50 μL，200 μL，800 μL和1.8 mL TDCPP儲(chǔ)備液，各自用稀釋液定容到1 L，即為濃度分別為5 μg/L， 20 μg/L， 80 μg/L和180 μg/L的暴露液。

1.2 斑馬魚的養(yǎng)殖與胚胎的收集

實(shí)驗(yàn)所用的斑馬魚購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所，健康狀況良好。將斑馬魚雄雌分開放置在實(shí)驗(yàn)條件相同的魚缸中，魚缸所用水來自經(jīng)過充分曝氣且滅菌后的循環(huán)水箱。水溫恒溫28 ℃，pH值6.5～7，每日投喂三次新鮮的豐年蟲卵。豐年蟲卵孵化方法如下：取蟲卵3 g和食用鹽20 g加入到1 L水中，曝氣孵化28 h，水溫恒溫28 ℃。親代斑馬魚養(yǎng)殖30天后，可用于孵化胚胎。按照雌魚與雄魚1∶2選取健康活潑的成年斑馬魚進(jìn)行交配。在魚缸內(nèi)鋪放兩層網(wǎng)，防止親魚誤食魚卵。前一天晚上將雌雄斑馬魚共同放置在黑暗環(huán)境下12 h，第二天光照追逐，光照1 h后在顯微鏡下挑選囊胚期的胚胎用于暴露實(shí)驗(yàn)。

1.3 暴露實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置濃度為0， 5 μg/L， 20 μg/L，80 μg/L和180 μg/L的TDCPP暴露組，在5個(gè)直徑為180 mm的結(jié)晶皿中分別放入200 mL不同濃度的暴露液以及600個(gè)健康的斑馬魚胚胎，暴露斑馬魚胚胎至受精后168 h(168 haf)。每隔一天更換染毒溶液，并挑選出雜物和死亡胚胎。

1.4 急性發(fā)育指標(biāo)統(tǒng)計(jì)方法

在暴露期間，觀察胚胎的形態(tài)發(fā)育，記錄并統(tǒng)計(jì)胚胎24 haf，48 haf，72 haf，96 haf以及120 haf的存活率、48 haf和84 haf的心率、72 haf的孵化率和畸形率，以及168 haf的體長、體重，并繪制成柱形圖進(jìn)行比較分析。具體統(tǒng)計(jì)方法參照文獻(xiàn)[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚胚胎存活率的影響

圖1為急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚胚胎存活率的影響。

圖1 急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚胚胎存活率的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，TDCPP的急性暴露引起了斑馬魚胚胎存活率的降低，高濃度暴露組尤為明顯。在濃度為5 μg/L，20 μg/L與80 μg/L的TDCPP暴露液中，24～120 haf胚胎/幼魚存活率分別從94%降低至80%，91%降低至78.4%，88%降低至78%，但是與對(duì)照組120 haf時(shí)的96%相比差異不太顯著。在高濃度暴露組180 μg/L TDCPP中，24～120 haf胚胎/幼魚存活率由73%顯著降低至45%，并且在72～96 hpf，存活率降低幅度較大，說明幼魚孵化出膜后，失去了絨毛膜的保護(hù)作用，直接暴露于高濃度的TDCPP導(dǎo)致其大量死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明TDCPP能夠直接誘發(fā)胚胎死亡，且高濃度的TDCPP對(duì)胚胎死亡率的影響更大。Xu等研究也發(fā)現(xiàn)較大濃度的TDCPP會(huì)直接誘發(fā)斑馬魚胚胎死亡[12]。

2.2 急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響

圖2為48 haf和84 haf急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響。

圖2 急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，TDCPP暴露組斑馬魚胚胎心率有所降低，但是差異不顯著；而在84 haf，暴露濃度為180 μg/L時(shí)，TDCPP對(duì)斑馬魚胚胎心率的抑制作用較為明顯，呈現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系，心率從對(duì)照組的116次/min降低到70次/min，下降了39.66%。通過此圖還可以看出，在斑馬魚胚胎/幼魚從48 haf到84 haf的生長發(fā)育過程中，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的心率差有所減弱，說明胚胎/幼魚適應(yīng)了外源物質(zhì)的刺激。石亞楠等研究也表明心率可以作為研究斑馬魚胚胎毒性的一個(gè)重要指標(biāo)[13]。

2.3 急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響

圖3為72 haf急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響。

圖3 急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，72 haf TDCPP暴露組中斑馬魚胚胎的孵化率呈下降趨勢(shì)，180 μg/L暴露組顯著下降了19.56%，說明TDCPP能夠抑制胚胎的孵化，并且呈濃度依賴關(guān)系。由此可知在卵裂前，TDCPP就可以通過生物膜滲透進(jìn)去，對(duì)胚胎進(jìn)行毒性作用，進(jìn)而抑制胚胎的孵化出膜。高丹等研究表明有機(jī)磷阻燃劑濃度與斑馬魚胚胎的孵化率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[14]，與本研究結(jié)果一致。

2.4 急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚畸形率的影響

圖4為72 haf急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚畸形率的影響。

圖4 急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚畸形率的影響

由圖4可知，20 μg/L，80 μg/L，180 μg/L暴露組72 haf幼魚畸形率較對(duì)照組顯著增加，分別由對(duì)照組的6.98%增加至15.23%，30.64%與37.3%。在5 μg/L暴露組中雖然幼魚也出現(xiàn)了形態(tài)學(xué)的異常，但是與對(duì)照組沒有顯著差異。高濃度暴露組致畸的主要原因可能是因TDCPP的濃度超過了胚胎所能承受的范圍，導(dǎo)致胚胎細(xì)胞凋亡，或者發(fā)生DNA損傷，影響與發(fā)育直接相關(guān)的功能基因和蛋白表達(dá)，最終誘發(fā)幼魚畸形。圖5為在急性暴露期間TDCPP導(dǎo)致的幼魚形態(tài)學(xué)異常，包括尾部畸形、卵黃囊水腫和心包水腫。本研究結(jié)果說明TDCPP對(duì)斑馬魚胚胎具有明顯的致畸效應(yīng)。

(a)發(fā)育正常 (b)尾部畸形

(c)卵黃囊水腫 (d)心包水腫 圖5 斑馬魚發(fā)育形態(tài)

2.5 急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚幼魚體重、體長的影響

圖6為168 haf急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚幼魚體重、體長的影響。

圖6 急性暴露TDCPP對(duì)斑馬魚幼魚體重、體長的影響

由圖6可知，在暴露實(shí)驗(yàn)進(jìn)行7天后，幼魚的體重沒有顯著的變化(圖6a)，高濃度暴露組幼魚體重僅從對(duì)照組的11.165 mg減少到10.632 mg，差異不顯著，但是體長則受到顯著抑制(圖6b)，高濃度暴露組幼魚的體長由對(duì)照組的2 624.35 μm顯著降低至2 170.18 μm，表明急性暴露TDCPP能夠顯著抑制幼魚的生長發(fā)育。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證明，急性暴露TDCPP能夠影響斑馬魚胚胎/幼魚的發(fā)育，表現(xiàn)為存活率降低、畸形率增加、孵化率降低以及心率和體長受到顯著的抑制，并且這種影響隨著暴露液TDCPP濃度的增大而明顯。