謝明紅，郭亞麗，祁亞楠，李亞萍，陳 丹，吳紀(jì)珍，齊 詠

(1.河南省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450000；2.河南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450000)

靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism，VTE)包括肺栓塞(pulmonary embolism，PE)和深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)。造成VTE的因素包括內(nèi)皮損傷或活化、血流減少和血液高凝狀態(tài)，即Virchow三聯(lián)征。VTE是一種具有高遺傳性的復(fù)雜疾病，研究顯示，50%以上VTE患者與遺傳學(xué)危險(xiǎn)因素有關(guān)[1]。F11基因[2-6]位于4q35.2位點(diǎn)上，編碼凝血因子XI，其多態(tài)性與VTE密切相關(guān)[4，7]。最近研究顯示，F(xiàn)11基因rs2036914 T/C多態(tài)性與VTE的發(fā)生密切相關(guān)，但研究人群多來源于國(guó)外，種族多為高加索人、非洲人等[ 4,8-11]。但是目前關(guān)于中國(guó)人的F11基因rs2036914 T/C多態(tài)性與VTE的研究，國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究采用PSTAR高通量位點(diǎn)測(cè)序技術(shù)研究F11的rs2036914 T/C位點(diǎn)多態(tài)性，并分析其與河南省漢族人口VTE的關(guān)系，為基因治療的機(jī)制方面提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年3月至2017年3月在河南省人民醫(yī)院住院治療的VTE患者82例為病例組，其中男46例，女36例，年齡21～89(60.00±16.22)歲，繼發(fā)性VTE 63例(繼發(fā)組)，其中PE 18例，DVT 55例。另選擇性別、年齡匹配的正常志愿者82例作為對(duì)照組，男46例，女36例，年齡18～89(60.00±16.73)歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。病例組和對(duì)照組患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～89歲；(2)DVT診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)血管外科學(xué)組制定的DVT診斷和治療指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]；(3)PE的診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)肺栓塞與肺血管病學(xué)組制定的肺血栓栓塞癥診治與預(yù)防指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]；(4)臨床資料完整；(5)患者及家屬對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病及已經(jīng)使用溶栓、抗凝藥物的患者。

1.3 主要試劑與儀器血液基因組DNA提取試劑盒、測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒購(gòu)自武漢康昕瑞基因健康科技有限公司，100 bp DNA Ladder購(gòu)自Takara寶生物工程(大連)有限公司，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。基因測(cè)序儀購(gòu)自深圳華因康基因科技有限公司、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購(gòu)自德國(guó)艾本德公司，-80 ℃冰箱購(gòu)自青島海爾股份有限公司，渦旋震蕩儀購(gòu)自海門其林貝爾儀器制造有限公司，NanoDrop超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，凝膠成像儀購(gòu)自上海天能科技有限公司，電泳儀、垂直電泳槽購(gòu)自上海天能科技有限公司，水平電泳槽購(gòu)自北京市六一儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 靜脈血采集病例組患者入院確診VTE后，在應(yīng)用抗凝藥物治療前采集空腹外周靜脈血，對(duì)照組受試者采集清晨空腹外周靜脈血，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。

1.4.2 全血DNA的提取和多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)區(qū)域序列的獲取采用DNA提取試劑盒，按照操作步驟提取全血DNA 2 μg。應(yīng)用Primer premier 5引物設(shè)計(jì)軟件在多態(tài)性位點(diǎn)附近100 bp左右區(qū)域設(shè)計(jì)引物，引物序列在國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確定引物特異性，上游引物序列：5′-CAGAAGGCTCGTTCCAGACC-3′，下游引物序列：5′-TTGTCTTGGAGACAAGGAGTGC-3′，PCR反應(yīng)體系共25 μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min；10 ℃保存。目的片斷連接磁珠，對(duì)連接目的片斷的磁珠進(jìn)行回收混合。

1.4.3 高通量測(cè)序開啟測(cè)序儀，使用PStar軟件中初始化操作模塊，點(diǎn)擊初始化(I)；將反應(yīng)小室上的進(jìn)液口與測(cè)序儀XY平臺(tái)一端與泵相連的軟管相連，將反應(yīng)小室上的出液口與廢液瓶上軟管相連；使用PStar軟件，從裝有Buffer離心管中吸取溶液，用于測(cè)序；在PStar主控界面中點(diǎn)擊“檢測(cè)(T)”，進(jìn)入“硬件檢測(cè)(H)”模塊。將試劑盒中10×Seq Buffer B、10×Seq Buffer C、10×Seq Buffer W用ddH2O稀釋10倍，配制成 1×Seq Buffer B、1×Seq Buffer C、1×Seq Buffer W后放在測(cè)序儀的Work Station B區(qū)位置上；加入上述組分后混勻，3 000 r·min-1離心30 s，放入測(cè)序儀相應(yīng)試劑區(qū)域。在PStar 主控界面中依次點(diǎn)擊設(shè)置，進(jìn)行試劑參數(shù)設(shè)置；在PStar主控界面中點(diǎn)擊“Run”Custom功能模塊，點(diǎn)擊Start，運(yùn)行測(cè)序程序。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組受試者基因型和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用logistic回歸模型分析F11基因rs2036914 T/C多態(tài)性與VTE的相關(guān)性。從logistic回歸模型中得到優(yōu)勢(shì)比(odds ratio,OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組和對(duì)照組受試者F11基因rs2036914基因型和等位基因頻率比較結(jié)果見表1。對(duì)照組和病例組受試者基因型分布均符合Handy-Weinberg平衡(P>0.05)。病例組患者等位基因C頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=2.192，95%CI：下限為1.298、上限為3.703,P<0.05)。

表1 病例組和對(duì)照組受試者 F11基因rs2036914 基因型和等位基因頻率比較

注：與對(duì)照組比較aP<0.05。

2.2 病例組和對(duì)照組受試者F11基因rs2036914位點(diǎn)遺傳模型的分析結(jié)果見表2。病例組患者隱性遺傳模型(CC比CT+TT)中CC基因型頻率高于對(duì)照組(OR= 3.219，95%CI：下限為1.690、上限為6.126，P<0.01)；病例組隱性遺傳模型(CC+CT比TT)中TT+CT基因型頻率與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.000，95%CI：下限為0.196、上限為5.106，P>0.05)。

表2 病例組和對(duì)照組受試者F11基因rs2036914位點(diǎn)遺傳模型的分析

注：與對(duì)照組比較aP<0.05。

2.3 繼發(fā)組和對(duì)照組受試者F11基因rs2036914 T/C多態(tài)性比較結(jié)果見表3。繼發(fā)組患者C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=2.392，95%CI下限為1.338、上限為4.277，P<0.05)。

表3 繼發(fā)組和對(duì)照組受試者F11基因rs2036914 T/C多態(tài)性比較

注：與對(duì)照組比較aP<0.05。

3 討論

VTE是凝血因子、凝血蛋白和纖溶蛋白等多種因素參與的一類機(jī)制復(fù)雜的疾病，遺傳因素和獲得性因素共同作用導(dǎo)致VTE的發(fā)生。目前，已發(fā)現(xiàn)遺傳性易栓癥存在多種基因缺陷種類，但具有種族和地域性差異[14]。2011年我國(guó)一項(xiàng)22省市60多家三甲醫(yī)院參與的研究顯示，近15年來住院患者PE發(fā)病率逐年上升，已達(dá)1%，該水平已與白種人群VTE發(fā)病率持平[15]。然而，關(guān)于中國(guó)人群患VTE的遺傳方面的研究甚少。

凝血因子XI是一種血漿絲氨酸蛋白酶原，在體內(nèi)和體外的凝血途徑中都起著重要作用，在血漿止血的起始和擴(kuò)增階段起著橋梁作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)11基因敲除小鼠的血栓形成率降低[5]。凝血因子XI水平升高與血栓形成有關(guān)[7]。LI等[9]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)11基因rs2036914多態(tài)性是VTE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Meta分析顯示，F(xiàn)11基因rs2036914多態(tài)性與VTE顯著相關(guān)[16]，其研究的人群來源于國(guó)外，但目前關(guān)于中國(guó)人F11基因rs2036914多態(tài)性與VTE的關(guān)系尚未見報(bào)道。

本研究納入者均為河南省漢族VTE患者，應(yīng)用PSTAR高通量位點(diǎn)測(cè)序技術(shù)初步探討凝血因子F11基因rs2036914 T/C多態(tài)性與VTE的相關(guān)性，結(jié)果顯示，等位基因C為風(fēng)險(xiǎn)基因，其攜帶者發(fā)生VTE風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加，結(jié)合繼發(fā)組的分析結(jié)果，提示攜帶等位基因C的患者更具易感性，與以往的研究結(jié)果一致[16-17]。本研究結(jié)果顯示，病例組患者隱性遺傳模型中CC基因型頻率高于對(duì)照組，其95%CI下限大于1，提示基因型CC可能為VTE的遺傳危險(xiǎn)因素，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[16]相符。但本研究為單中心小樣本研究，未進(jìn)一步檢測(cè)血樣本中凝血因子XI的水平及活化水平。F11基因多態(tài)性與中國(guó)人群患VTE的相關(guān)性有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，F(xiàn)11基因rs2036914 T/C多態(tài)性可能是河南省漢族人口發(fā)生VTE的遺傳危險(xiǎn)因素，在外傷或手術(shù)的影響下，攜帶等位基因C人群罹患VTE的風(fēng)險(xiǎn)更高。