夏天光，刁云鋒，畢 瑩，張 健，陳江龍，董化江，董月青

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，天津 300162)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種能導(dǎo)致認(rèn)知能力嚴(yán)重下降的神經(jīng)退行性疾病[1]，其主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變及語(yǔ)言障礙等神經(jīng)精神癥狀。β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)是導(dǎo)致AD的關(guān)鍵因素，常以單體、可溶性或不溶性寡聚體及不溶性淀粉樣纖維等形式存在，其聚集體具有明顯的神經(jīng)毒性，可在AD患者大腦神經(jīng)細(xì)胞間形成老年斑，誘發(fā)神經(jīng)元變性與凋亡。糖化β-淀粉樣蛋白(glycated β-amyloid protein，Aβ-AGE)是一種高級(jí)糖化終產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)，其是以Aβ為底物的蛋白質(zhì)氨基與還原糖及其衍生物的羰基在無(wú)酶條件下發(fā)生一系列糖化反應(yīng)而產(chǎn)生的一種不溶于水、不被降解的交聯(lián)體。AGEs通過(guò)AGEs受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)與神經(jīng)元發(fā)生作用，可誘導(dǎo)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激，促使相關(guān)細(xì)胞因子和Aβ的釋放。Aβ是RAGE的一種配體，RAGE可促進(jìn)Aβ生成，在Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性中起重要作用[5]。研究顯示，Aβ-AGE可進(jìn)一步促進(jìn)Aβ聚積，且有更強(qiáng)的神經(jīng)細(xì)胞毒性，在AD發(fā)病過(guò)程中的致病性強(qiáng)于Aβ[2-3]。本課題組既往研究表明，Aβ在體內(nèi)外均能形成Aβ-AGE，且在體外Aβ-AGE會(huì)加劇Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性[4]，但在體實(shí)驗(yàn)中，Aβ-AGE對(duì)AD樣大鼠行為學(xué)改變及其作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在觀察Aβ-AGE對(duì)AD樣大鼠認(rèn)知功能的影響，并探討RAGE介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在Aβ-AGE對(duì)AD樣大鼠認(rèn)知功能影響中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康無(wú)特定病原體級(jí)成年Sprague Dawley雄性大鼠40只，體質(zhì)量 280～320 g，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供,動(dòng)物許可證號(hào)：0047126。

1.2 主要試劑與儀器小鼠單克隆RAGE抗體(receptor for advanced glycation endproducts mouse monoclonal antibody,Anti-RAGE)、小鼠單克隆β-肌動(dòng)蛋白抗體(beta-actin mouse monoclonal antibody，Anti-β-actin)(美國(guó)Millipore公司),人β-淀粉樣蛋白1-42(amyloid β1-42，Aβ1-42)、甲基乙二醛(methylglyoxal,MG)(美國(guó)Sigma公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(美國(guó)Pierce公司)，聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi-luminescence，ECL)液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，二氨基聯(lián)苯胺 (diaminobenzidine，DAB) 顯色試劑盒、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(中國(guó)北京索萊寶科技有限公司)；DMS-2型Morris水迷宮測(cè)試系統(tǒng)(海欣曼科教設(shè)備有限公司)。

1.3 Aβ-AGE的制備無(wú)菌條件下取1 g·L-1的Aβ1-420.5 mL置于EP管中，加入0.5 mmol·L-1的MG緩沖液0.5 mL，在37 ℃孵育箱溫育1個(gè)月，將混合液移入透析袋，扎緊透析袋并置入 1 mL 的 0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation，PBS)中，于 4 ℃冰箱內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)透析,持續(xù)48 h，每 4 h 更換1次 PBS，除去MG，成功制備Aβ-AGE。將透析完畢的Aβ-AGE混合液于超凈臺(tái)濾過(guò)除菌，EP管分裝，密封，-20 ℃儲(chǔ)存。

1.4 動(dòng)物分組與模型制備將40只大鼠隨機(jī)分為Aβ組、Aβ+Anti-RAGE組、Aβ-AGE組、Aβ-AGE+Anti-RAGE組，每組10只。根據(jù)CHEN等[6]文獻(xiàn)方法制備大鼠AD樣模型。各組大鼠按 6 mL·kg-1的劑量給予60 g·L-1水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠固定于立體定向儀器上，選取前囟后1.0 mm、中線旁開(kāi)1.5 mm、深度3.8 mm的位置，行左側(cè)側(cè)腦室注射，將相應(yīng)的試劑溶于0.01 mL 30 g·L-1的BSA中，1次性注入左側(cè)側(cè)腦室，其中Aβ組大鼠給予Aβ 5 μg，Aβ+Anti-RAGE組大鼠給予Aβ 5 μg和RAGE抗體 Anti-RAGE 50 μg，Aβ-AGE組大鼠給予Aβ-AGE 5 μg，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠給予Aβ-AGE 5 μg 和Anti-RAGE 50 μg。

1.5 各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，包括潛伏期(即大鼠從入水至找到平臺(tái)所用的時(shí)間)、目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)等。在立體定向注射后第2～7 天，每只大鼠每天在第III象限訓(xùn)練 1 次，每次游泳的時(shí)間限為 60 s，大鼠爬上平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上停留10 s；如在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)者，系統(tǒng)自動(dòng)停止記錄，潛伏期記為 60 s，由測(cè)試者引導(dǎo)大鼠至平臺(tái)，使其休息30 s；連續(xù)訓(xùn)練6 d，每日進(jìn)行4次，記錄大鼠尋找隱匿平臺(tái)的潛伏期。立體定向注射后第9天移去水下平臺(tái)，讓大鼠自由游泳60 s尋找平臺(tái)，記錄大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)(即穿越平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù))。

1.6 Western blot法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中RAGE的表達(dá)注射后第9天，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取5只大鼠斷頭取腦，冰上分離海馬組織，取適量海馬組織放入預(yù)冷裂解液(裂解液成分：三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽0.010 mol·L-1，氟化鈉 0.050 mol·L-1，正釩酸鈉0.001 mol·L-1，乙二胺四乙酸0.001 mol·L-1，甲脒0.001 mol·L-1，苯基甲基磺酰氟0.001 mol·L-1，0.001 mol·L-1絲氨酸蛋白酶抑制劑，基礎(chǔ)溶劑為雙蒸水)中，加入研磨珠，用組織研磨儀研磨60 s，冰上裂解 30 min，4 ℃ 12 000×g離心15 min，取上清液，加入聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液制備大鼠腦組織蛋白樣本。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)樣品中蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳：80 V電泳 30 min，之后120 V電泳50 min，300 mA 轉(zhuǎn)膜 90 min，Tris-HCl 緩沖鹽溶液洗膜 2 min，體積分?jǐn)?shù) 50 g·L-1BCA封閉，室溫?fù)u床 1 h，Tris-HCl 緩沖鹽溶液洗膜 3 次，每次8 min，分別加入一抗RAGE和Anti-β-actin進(jìn)行孵育，其中RAGE和Anti-β-actin稀釋比例為 11 000，4 ℃過(guò)夜，次日洗膜3次，37 ℃ 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(15 000)孵育1 h，洗膜3次，采用ECL液進(jìn)行顯色，膠片曝光，定影，顯影，使用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，灰度值高則表明蛋白表達(dá)量多。

1.7 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組大鼠大腦皮層中RAGE蛋白表達(dá)注射后第9天，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取5只大鼠，按6 mL·kg-1的劑量給予60 g·L-1水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，經(jīng)心臟先灌注100 mL生理鹽水，然后灌注40 g·L-1的多聚甲醛溶液400 mL，取大鼠大腦組織置于 40 g·L-1的多聚甲醛溶液20 mL中固定24 h。采用震蕩切片機(jī)行大腦組織連續(xù)切片，制備海馬組織的冠狀切片，厚度為20 μm。每只大鼠選取3～5個(gè)連續(xù)切片，采用RAGE抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：取固定好的大腦震蕩切片用 0.01 mmol·L-1的PBS震洗3次，每次5 min；然后滴加體積分?jǐn)?shù)3 g·L-1的H2O2緩沖溶液以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫放置15 min，用 0.01 mmol·L-1的PBS震洗3次，每次 5 min；加入50 g·L-1BSA封閉60 min；加入一抗RAGE(11 000)4 ℃過(guò)夜；次日加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37 ℃ 孵育1 h，并用DAB顯色 2 min，中性樹(shù)膠封片，隨機(jī)選取2組大鼠大腦皮層切片各3張，置于倒置顯微鏡下，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)視野，采用IPP 6.0軟件計(jì)算大鼠大腦皮層RAGE陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒狀物質(zhì)沉積則為RAGE表達(dá)陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠潛伏期比較結(jié)果見(jiàn)表1。在注射后第2天，各組大鼠潛伏期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.767，P>0.05)。注射后第3～7天，各組大鼠潛伏期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.167、25.050、56.980、62.380、122.200，P<0.05)；Aβ-AGE組大鼠潛伏期顯著長(zhǎng)于Aβ組，Aβ+Anti-RAGE組大鼠潛伏期顯著短于Aβ組，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠潛伏期顯著短于Aβ-AGE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 4組大鼠潛伏期比較

n/s234567Aβ1059.96±1.0549.37±1.6832.10±3.0533.13±3.5020.80±2.719.73±1.62Aβ-AGE1060.07±1.2157.83±3.25a42.27±1.10a42.53±4.42a34.57±1.40ba29.77±2.66aAβ+Anti-RAGE1059.00±1.7344.67±2.52a23.00±3.46a22.30±2.52a14.32±3.05a5.34±2.31aAβ-AGE+Anti-RAGE1060.07±1.9351.77±1.86b36.83±2.25b33.30±1.26b26.03±1.65b17.57±1.69bF3.7679.16725.05056.98062.380122.200P0.0600.0100.0000.0000.0000.000

注：與Aβ組比較aP< 0.05；與Aβ-AGE組比較bP<0.05。

2.2 4組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間比較結(jié)果見(jiàn)表2。在立體定向注射后第9天，各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.930、13.560，P<0.05)。Aβ-AGE組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著小于Aβ組，Aβ+Anti-RAGE組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著大于Aβ組，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著大于Aβ-AGE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 4組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間比較

n/sAβ103.60±0.4629.33±2.52Aβ-AGE101.99±0.11a19.17±0.76aAβ+Anti-RAGE104.23±0.71a31.67±3.06aAβ-AGE+Anti-RAGE103.23±0.25b26.83±2.25bF12.93013.560P0.0000.000

注：與Aβ組比較aP< 0.05；與Aβ-AGE組比較bP< 0.05。

2.3 4組大鼠海馬組織中RAGE蛋白表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。注射后第9天，Aβ組、Aβ+Anti-RAGE組、Aβ-AGE組、Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.56±0.03、0.47±0.08、0.77±0.11、0.48±0.07，各組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.626，P<0.05)；其中Aβ-AGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于Aβ組(P<0.05)，Aβ+Anti-RAGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對(duì)表達(dá)量與Aβ組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于Aβ-AGE組(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Aβ組、Aβ+Anti-RAGE組、Aβ-AGE組、Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠大腦皮層中RAGE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(25.10±0.15)、(17.23±2.25)、(38.17±2.16)、(23.16±1.20)個(gè)·cm-2，各組大鼠大腦皮層中RAGE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=76.370，P<0.01)；Aβ-AGE組大鼠大腦皮層中RAGE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于Aβ組(P<0.01)，Aβ+Anti-RAGE組大鼠皮層中RAGE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于Aβ組(P<0.01)；Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠皮層中RAGE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于Aβ-AGE組(P<0.01)。

A：Aβ組；B：Aβ-AGE組；C：Aβ+Anti-RAGE組；D：Aβ-AGE+Anti-RAGE組。

圖1 各組大鼠海馬組織中RAGE表達(dá)(Western blot)

Fig.1 Expression of RAGE in hippocampus of rats in each group (Western blot)

A：Aβ組；B：Aβ-AGE組；C：Aβ+Anti-RAGE組；D：Aβ-AGE+Anti-RAGE組。

圖2 各組大鼠大腦皮層中RAGE陽(yáng)性表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，×400)

Fig.2 Positive expression of RAGE in the cerebral cortex of rats in each group(immunohistochemical staining,×400)

3 討論

AD是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性病變，其主要病理學(xué)特征是位于細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)和位于細(xì)胞外的老年斑。前者主要由過(guò)度磷酸化的tau蛋白聚積而成，后者的主要成分是Aβ[7]。大腦中葡萄糖代謝嚴(yán)重紊亂與AD的發(fā)展密切相關(guān)[8-9]，其會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)大量AGEs的形成和積聚，而AGEs已被證明與AD的發(fā)生密切相關(guān)[10-11]。AGEs的產(chǎn)生是一種涉及細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的復(fù)雜的非酶促階梯式反應(yīng)過(guò)程[10]。在葡萄糖代謝和氧化應(yīng)激過(guò)程中，AGEs的水平會(huì)顯著提高，AGEs會(huì)導(dǎo)致許多活性羰基化合物的形成，而這些羰基化合物又可與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成AGEs。AD患者或動(dòng)物模型體內(nèi)的AGEs水平明顯升高。體外研究顯示，AGEs修飾增加淀粉樣蛋白的錯(cuò)誤折疊[2]。在體研究表明，AGEs與AD病理性蛋白Aβ是共定位的[12]。以上研究提示，AGE修飾的蛋白質(zhì)可能與AD的病理和發(fā)病機(jī)制有關(guān)。本課題組以往研究表明，Aβ-AGE可加重Aβ介導(dǎo)的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性[13]，但其作用和潛在的體內(nèi)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。為驗(yàn)證Aβ-AGE對(duì)AD樣大鼠認(rèn)知功能的影響，本研究將Aβ-AGE注入大鼠側(cè)腦室，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Aβ組相比，Aβ-AGE能顯著延長(zhǎng)大鼠尋找隱匿平臺(tái)的潛伏期，減少穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間，表明Aβ-AGE可加重AD樣大鼠認(rèn)知功能障礙。

RAGE是免疫球蛋白家族中的一個(gè)多配體受體，可與AGEs和Aβ結(jié)合。研究表明，RAGE在Aβ介導(dǎo)的細(xì)胞功能紊亂中起重要作用[14]。當(dāng)Aβ在AD患者腦中累積時(shí)，RAGE表達(dá)水平增加，這種機(jī)制可能加重RAGE與配體相互作用所引起的細(xì)胞功能障礙[15]。之前本課題組觀察到RAGE參與了Aβ-AGE對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元的損傷作用[13],但尚不清楚RAGE是否參與在體實(shí)驗(yàn)中Aβ-AGE誘導(dǎo)的AD樣認(rèn)知功能障礙。本研究通過(guò)觀察RAGE是否參與Aβ-AGE對(duì)AD樣大鼠認(rèn)知功能的影響，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ-AGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白表達(dá)水平與Aβ組比較明顯增高，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于Aβ-AGE組。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果同樣顯示，Aβ-AGE組大鼠大腦皮層中RAGE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于Aβ組，Aβ+Anti-RAGE組大鼠大腦皮層中RAGE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于Aβ組；Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠大腦皮層中RAGE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于Aβ-AGE組，提示RAGE參與了Aβ-AGE誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙這一過(guò)程。

細(xì)胞內(nèi)的AGEs可能是直接通過(guò)交聯(lián)作用對(duì)蛋白產(chǎn)生影響，而細(xì)胞外的AGEs可能是通過(guò)與其受體相結(jié)合將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)而影響細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)。有證據(jù)表明，RAGE表達(dá)的增加可使其誘導(dǎo)更為嚴(yán)重的細(xì)胞功能紊亂[16]。為了探討RAGE介導(dǎo)的通路是否與Aβ-AGE的作用相關(guān)，本研究使用RAGE抗體阻斷RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，結(jié)果觀察到立體定向注射后第3～7天，Aβ+Anti-RAGE組大鼠尋找隱匿平臺(tái)的潛伏期顯著短于Aβ組，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠尋找隱匿平臺(tái)的潛伏期同樣顯著短于Aβ-AGE組；在立體定向注射后第9天，Aβ+Anti-RAGE組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著長(zhǎng)于Aβ組，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間同樣顯著大于Aβ-AGE組；以上結(jié)果提示，給予RAGE抗體阻斷后，可以有效減輕大鼠空間記憶功能損傷，由此提示Aβ-AGE誘導(dǎo)的AD樣認(rèn)知功能障礙可能是通過(guò)干預(yù)RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而產(chǎn)生的。

綜上所述，Aβ-AGE可加重AD樣大鼠的認(rèn)知功能障礙，并增加AD樣大鼠腦組織RAGE的表達(dá)，而RAGE抗體能有效減輕由Aβ-AGE誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙。本研究進(jìn)一步證實(shí)了Aβ-AGE可加重大鼠的神經(jīng)損害，其機(jī)制可能是通過(guò)激活RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)加重AD樣大鼠的認(rèn)知功能障礙，Aβ-AGE和RAGE可能成為新的AD治療靶點(diǎn)。