田 文， 韓 璐， 高 原， 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

刺參(OplopanaxelatusNakai)又名東北刺人參，為五加科刺人參屬，多年生落葉灌木，是長(zhǎng)白山地區(qū)珍貴的瀕危藥用植物之一，國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，也稱為“木本人參”[1]。刺參中含有多種生物活性物質(zhì)，主要有多糖類、多酚類、黃酮類、皂苷類、蒽醌類、揮發(fā)油、不飽和脂肪酸和微量元素等[2-3]，具有抗腫瘤、抗真菌、抗氧化、抗炎、抑制黑色素生成及提高免疫力等藥理作用[4-8]。

生物體在生理代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列活性氧自由基(ROS)，適量的自由基有助于清除病原微生物、抑制癌細(xì)胞等，但是過(guò)多的ROS會(huì)造成包括膜脂、蛋白質(zhì)等細(xì)胞組分的損傷，甚至作用于細(xì)胞質(zhì)中調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)的表達(dá)。研究表明，癌癥、衰老或其它疾病大都與過(guò)量自由基的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)，因此抗氧化自由基的產(chǎn)品研發(fā)及其重要[9-11]。目前，市場(chǎng)上抗氧劑主要分為人工合成抗氧劑與天然抗氧化劑，其中，人工合成抗氧化劑雖然成本低、抗氧化效果明顯，但安全性低，對(duì)人體存在一定的毒害作用。而植物提取物是天然抗氧化劑，因其具有安全無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為抗氧化研究的熱點(diǎn)[12-14]。

1 材料與方法

1.1 材料

參照李慧娟[18]的方法誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)東北刺人參不定根。將增殖培養(yǎng)的不定根切成1 cm大小，并稱取80 g(鮮重)接種于含有16 L液體培養(yǎng)基的20 L氣球型生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)基為MS+吲哚-3-丁酸(IBA)3.0 mg/L +蔗糖50 g/L，pH值5.8，通氣量調(diào)節(jié)為100 mL/min，在25 ℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)。為了提高活性物質(zhì)的積累，在培養(yǎng)30 d時(shí)向反應(yīng)器內(nèi)加入經(jīng)濾膜過(guò)濾的茉莉酸甲酯(200 μmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)處理，8 d后收獲不定根。將反應(yīng)器內(nèi)收獲的不定根在流水下沖洗，吸干表面水分后置于45 ℃恒溫烘干箱中烘干48 h，收集不定根干品作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 刺參不定根不同溶劑萃取物的制備

刺參不定根萃取過(guò)程如圖1。

圖1 刺參不定根萃取過(guò)程

將磨碎的不定根干粉置于錐形瓶中，加入80%甲醇溶液(質(zhì)量∶體積=1∶3)，37 ℃條件下超聲提取1 h，過(guò)濾并收集濾液，重復(fù)3次并合并濾液，于45 ℃減壓濃縮置于烘干箱干燥至恒重，即得不定根甲醇粗提物。取10 g甲醇粗提物用蒸餾水定容至100 mL，倒入體積為250 mL的分液漏斗，并加入100 mL正己烷，充分搖勻，靜止分層后取上層溶液即為正己烷萃取液；繼續(xù)收集下層溶液并倒入250 mL液漏斗中，加入100 mL二氯甲烷，充分搖勻，靜止分層后取下層溶液即為二氯甲烷萃取液。繼續(xù)收集上層溶液，倒入250 mL分液漏斗中，加入100 mL乙酸乙酯，充分搖勻，靜止分層后取上層溶液即為乙酸乙酯萃取液；繼續(xù)收集下層溶液，加入100 mL正丁醇溶液，充分搖勻，靜止分層后取下層溶液即為正丁醇萃取液，并收集上層水溶液(圖1)。分別將正己烷萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及水層溶液于45 ℃減壓濃縮至膏狀，冷凍干燥至恒重后，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 DPPH自由基清除能力研究

參照Sarikurkcu等[20]的方法，精密稱取不同不定根萃取物與甲醇粗提物50 mg，用甲醇溶液定容至50 mL，依次稀釋為0.8、1.6、3.2、6.25、12.5、25.6、50、100 μg/mL，分別量取2 mL上述樣品至試管中，加入2 mL濃度為0.1 mM的DPPH溶液，避光反應(yīng)30 min，以甲醇溶液作對(duì)照組，利用紫外分光光度計(jì)在517 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算DPPH自由基清除能力，公式為：

I/%=(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照×100%

1.2.3 鐵離子鰲合能力研究

參照Fu等[21]的方法并作改進(jìn)，精密稱取不同不定根萃取物與甲醇粗提物1 g，用蒸餾水溶解并定容至10 mL，依次稀釋為0.2，0.3，0.6，1.3，2.5，5.0，10.0 μg/mL。分別量取1 mL至試管中，加入2.75 mL 蒸餾水和0.05 mL 2 mmol/L FeCl2溶液，搖勻，加入0.2 mL、5 mmol/L的啡咯嗪，室溫靜置10 min。以0.05 mL蒸餾水代替0.05 mL FeCl2溶液為對(duì)照組，以0.05 mL蒸餾水代替0.05 mL樣品稀釋液為空白組，利用紫外分光光度計(jì)在562 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算鐵離子鰲合能力，公式為：

I/%=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100%

1.2.4 鐵離子還原力研究

根據(jù)Oyaizu等[22]的方法并做改進(jìn)。取不定根萃取物與甲醇粗提物(濃度依次稀釋為 0，25，50，100，200，400，800 μg/mL)2.5 mL于試管中，加入pH值為6.6的0.2 mol/L PBS緩沖液2.5 mL和1% K3[Fe(CN)6]溶液2.5 mL，充分混勻，50 ℃條件下水浴20 min，冷卻至室溫后加入10%三氯乙酸(TCA)溶液2.5 mL。混勻后，5 000 rpm/min下離心15 min，取5 mL上清液，加入0.1% FeCl3溶液1 mL，反應(yīng)5 min后，利用紫外分光光度計(jì)在700 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算鐵離子還原力，公式為：

鐵離子還原力=(A樣品-A對(duì)照)-A空白

2 結(jié)果與分析

2.1 不定根提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的影響

對(duì)DPPH自由基清除能力進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取物的濃度與DPPH自由基清除能力呈正相關(guān)(圖2)。當(dāng)提取物的濃度升高時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除能力也隨之增強(qiáng)，當(dāng)乙酸乙酯萃取物在最低濃度0.8 μg/mL時(shí)，清除率超過(guò)20%，但當(dāng)提取物達(dá)到150 μg/mL后，自由基清除能力不再升高，且保持在最高清除能力。

圖2 不定根提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的影響

比較各萃取物DPPH自由基半最大效應(yīng)濃度(EC50)的結(jié)果，乙酸乙酯萃取物EC50最低，為7.5 μg/mL，依次是正丁醇萃取物(EC50=17.50 μg/mL)、甲醇粗提物(EC50=29.71 μg/mL)、二氯甲烷萃取物(EC50=34.48 μg/mL)、水層濃縮物(EC50=45.00 μg/mL)、正己烷萃取物(EC50=67.86 μg/mL)(表1)。由此可見(jiàn)，乙酸乙酯萃取物的DPPH自由基清除能力顯著好于其他萃取物。

表1 不定根萃取物DPPH清除能力比較

2.2 不定根提取物對(duì)鐵離子鰲合能力的影響

評(píng)價(jià)不定根萃取物對(duì)鐵離子螯合能力的影響發(fā)現(xiàn)(圖3)，不定根甲醇粗提物和5種萃取物均是良好的鐵離子螯合劑，隨著萃取物濃度的升高，鐵離子螯合能力也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)萃取物達(dá)到10 μg/mL濃度后，鐵離子螯合能力將保持在穩(wěn)定水平。

比較各萃取物Fe3+鰲合能力EC50時(shí)，效果最為顯著的是乙酸乙酯萃取物(EC50=0.81 μg/mL)。其次是正己烷萃取物(EC50=1.05 μg/mL)、正丁醇萃取物(EC50=1.77 μg/mL)、水層濃縮物(EC50=2.98 μg/mL)、甲醇粗提物(EC50=3.01 μg/mL)、二氯甲烷萃取物(EC50=3.21 μg/mL)(表2)。

圖3 不定根萃取物對(duì)鐵離子鰲合能力的影響

表2 不定根萃取物的鐵離子鰲合能力比較

2.3 不定根萃取物對(duì)鐵離子還原能力的影響

對(duì)不定根萃取物Fe2+還原力進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)(圖4)，A700nm(紫外分光光度計(jì)700 nm處的吸光值)越大，說(shuō)明還原能力越強(qiáng)。結(jié)果顯示，6種不同提取物均表現(xiàn)出良好的鐵離子還原能力，且隨著提取物濃度升高呈增強(qiáng)的趨勢(shì)。

經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)萃取物濃度均為800 μg/mL時(shí)，作用效果最好的是乙酸乙酯(A700 nm=1.13)，其次分別是正丁醇萃取物(A700 nm=1.10)、甲醇粗提物(A700 nm=0.95)、水層濃縮物(A700 nm=0.89)、二氯甲烷萃取物(A700 nm=0.77)、正己烷萃取物(A700 nm=0.62)(表3)。

圖4 不定根萃取物對(duì)鐵離子還原能力的影響

提取物還原能力(A700 nm)甲醇粗提物0.95二氯甲烷萃取物0.77乙酸乙酯萃取物1.13正己烷萃取物0.62正丁醇萃取物1.10水層濃縮物0.89

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，植物中的黃酮類化合物[23]、多糖類化合物[24]、多酚類化合物[25]均具有抗氧化活性。但由于不同溶劑的極性不同，導(dǎo)致植物活性物質(zhì)在不同溶劑中的溶解度不同，各萃取物的有效活性物質(zhì)含量也不同，不同溶劑萃取物的抗氧化能力也有所差異[26]。何靜等[27]對(duì)蓮蓬殼提取物依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取獲取5種萃取物，且乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力強(qiáng)于其他溶劑萃取物；周瑞等[28]發(fā)現(xiàn)，黃參的不同溶劑萃取物對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出不同的清除能力，其中乙酸乙酯萃取物對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，這與本研究結(jié)果相同。本研究以生物反應(yīng)器培養(yǎng)的刺參不定根為原材料，分別利用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)其甲醇提取物進(jìn)行萃取，并通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)研究了各萃取物的抗氧化活性。結(jié)果顯示，刺參不定根不同萃取物均具有良好的抗氧化能力，并隨著濃度的升高效果越明顯，乙酸乙酯萃取物的DPPH清除能力、鐵離子鰲合能力的EC50分別為7.5和0.81 μg/mL，鐵離子還原力A700 nm測(cè)定為1.13，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。綜上所述，刺參不定根提取物是一種天然的抗氧化劑，且乙酸乙酯萃取物抗氧化能力最強(qiáng)。