王欣亞， 吳委林， 南桂仙， 杜鑫宇， 任雅萍， 樸世領(lǐng)

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

煙草是一種以收獲葉片為主的經(jīng)濟(jì)作物，其葉數(shù)與經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益密切相關(guān)[1]。苗期低溫會(huì)促進(jìn)花芽分化，提早開(kāi)花，導(dǎo)致葉片較少。煙草早花，指在生長(zhǎng)過(guò)程中受到單個(gè)或多個(gè)因素的影響，以及未達(dá)到正常株高及有效葉數(shù)而提前開(kāi)花的現(xiàn)象[2]，內(nèi)在因素指煙草品種的遺傳特性[3]，進(jìn)而決定其生育特性及對(duì)環(huán)境的敏感性[4],外在因素包含的常見(jiàn)因素有，光周期、干旱及低溫脅迫等[5]。低溫是導(dǎo)致煙草早花的主要原因之一，發(fā)生早花現(xiàn)象的煙株表現(xiàn)為植株矮小，生長(zhǎng)勢(shì)弱，葉數(shù)銳減，并提前現(xiàn)蕾開(kāi)花[6-8]。我國(guó)煙區(qū)面積廣，氣溫變幅較大，早春低溫引起煙草早花是生長(zhǎng)過(guò)程中面臨的重要問(wèn)題，由于氣候條件不同，早花期的程度因年而異，嚴(yán)重情況下，導(dǎo)致單株葉數(shù)減少6～7片以上，煙葉質(zhì)量不佳且減產(chǎn)10～20%[9]。挖掘耐早花基因，培育耐早花品種是最經(jīng)濟(jì)有效的解決措施。本試驗(yàn)，利用人工氣候箱控制溫度，通過(guò)體視顯微鏡法觀察低溫對(duì)花芽分化進(jìn)程的影響，旨在篩選耐低溫早花品種，基于相對(duì)早花指數(shù)(RE)和相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(RL)通過(guò)聚類(lèi)分析法對(duì)不同煙草品種對(duì)早花的耐易程度進(jìn)行分類(lèi)，為今后地方煙草品種低溫早花相關(guān)候選基因的定位與遺傳效應(yīng)分析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以25份煙草品種(系)為試材，其中包括18份烤煙品種(1～18)，7份曬煙品種(19～25)。

試驗(yàn)地為土壤質(zhì)地肥沃且灌溉條件優(yōu)良的延吉市小營(yíng)鎮(zhèn)河龍村，土層深厚，土地肥力適中，且地勢(shì)平坦，適宜煙草種植。2018年5月于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院通過(guò)人工氣候培養(yǎng)箱對(duì)25份煙草品種進(jìn)行低溫處理，參試品種詳情見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)品種(系)及編號(hào)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將25份煙草品種在3片真葉時(shí)假植于簡(jiǎn)塑盤(pán)中，每個(gè)品種4盤(pán)(100株/盤(pán))，溫室培養(yǎng)。待煙苗長(zhǎng)至5～6葉齡時(shí)，采用人工氣候箱，通過(guò)溫度控制對(duì)其進(jìn)行低溫處理，每個(gè)處理選取150株長(zhǎng)勢(shì)及形態(tài)基本一致的煙苗，將其轉(zhuǎn)入人工氣候箱(HPG-280H)，低溫脅迫設(shè)置溫度為(11±0.5) ℃，光暗時(shí)長(zhǎng)各12 h，處理時(shí)間為11 d。以室溫(24±2) ℃條件下培養(yǎng)作為對(duì)照。5月23日將低溫處理(T)品種及未處理(CK)的對(duì)照統(tǒng)一移栽至大田。于移栽后21 d開(kāi)始取莖尖觀察花芽分化進(jìn)程，并于移栽后35 d開(kāi)始調(diào)查有效葉數(shù)、現(xiàn)蕾數(shù)及現(xiàn)蕾率，依據(jù)調(diào)查結(jié)果計(jì)算相對(duì)早花指數(shù)(RE)和相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(RL)，并對(duì)其進(jìn)行早花耐易性分類(lèi)及鑒定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及測(cè)定方法

1.3.1 調(diào)查方法

利用體視顯微鏡觀察低溫誘導(dǎo)對(duì)花芽分化進(jìn)程的影響，移栽后35 d開(kāi)始調(diào)查大田煙株有效葉片數(shù)、現(xiàn)蕾數(shù)及現(xiàn)蕾率。以觀察及調(diào)查結(jié)果為依據(jù)分別計(jì)算相對(duì)早花指數(shù)(RE)及相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(RL)，并根據(jù)如下公式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.2 體視顯微鏡觀察法

移栽后21 d早晨開(kāi)始對(duì)煙株的莖尖取樣，使用醫(yī)用手術(shù)刀片切取自莖尖向下約5 cm處，用錫紙包好后放入裝有冰塊的冰盒取回，每2 d取1次，帶回實(shí)驗(yàn)室后對(duì)莖尖進(jìn)行切取，長(zhǎng)度2.0 cm左右，將其置于普通醫(yī)用注射器(20 mL)中，用于抽取莖尖組織內(nèi)空氣，抽取完畢后，放入FAA固定液的試劑瓶?jī)?nèi)固定保存。固定48 h后，采用體視顯微鏡(Olympus SZX7)觀察并對(duì)固定后的莖尖進(jìn)行解剖，調(diào)整好后拍照紀(jì)錄[10]。由于多個(gè)試驗(yàn)項(xiàng)目同時(shí)進(jìn)行，且體視顯微鏡觀察花芽分化進(jìn)程的鏡檢次數(shù)多、耗時(shí)久，本試驗(yàn)以觀察效果最佳的延曬9號(hào)和NC82這2個(gè)品種觀察圖為例進(jìn)行花芽分化過(guò)程的詳細(xì)說(shuō)明。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

試驗(yàn)以25份煙草品種的相對(duì)早花指數(shù)及相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)為基礎(chǔ)，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，運(yùn)用Statistica 10.0軟件，基于歐氏距離(Euclidean distance)，采用離差平方和法(Word’s method)進(jìn)行聚類(lèi)分析[11]。采用軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，用Duncan法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同煙草品種(系)苗期低溫誘導(dǎo)對(duì)花芽分化進(jìn)程的影響

2.1.1 花芽分化進(jìn)程的劃分

據(jù)前人多次煙草鏡檢及研究表明，不同煙草品種花芽分化過(guò)程的形態(tài)學(xué)變化大致相似[12]。煙草花芽分化大體可分6個(gè)時(shí)期(圖1)，分別是：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期(A)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化期(B)、花原基分化期(C)、花萼原基分化期(D)、花瓣、雄蕊原基形成期(E)、雌蕊原基形成期(F)。

2.1.2 低溫處理對(duì)不同煙草品種(系)花芽分化進(jìn)程的影響

2.1.2.1 低溫處理對(duì)曬煙花芽分化進(jìn)程的影響

7份曬煙品種的花芽分化進(jìn)程(表2)中，低溫處理組均較未處理組提早完成花芽分化。以延曬9號(hào)為例(圖2，3)，苗期未進(jìn)行低溫誘導(dǎo)處理的花芽分化是在移栽后21 d開(kāi)始，在移栽后42 d花芽分化基本完成；進(jìn)行低溫誘導(dǎo)處理的花芽分化開(kāi)始也是在移栽后21 d，而花芽分化基本完成是在移栽后41 d。由此可見(jiàn)，苗期進(jìn)行低溫處理的延曬9號(hào)花芽分化進(jìn)程比未進(jìn)行低溫處理的提前約1 d。

A：雄蕊原基；C：花瓣原基；G：雌蕊原基；L：葉原基殘留部分及葉原基；K：花萼原基；M：生長(zhǎng)點(diǎn)

品種(系)處理移栽后21 d移栽后25 d移栽后29 d移栽后33 d移栽后37 d移栽后41 d小碼稀TAB+C+D+E+FCKABCDE-F-8107TABC+D+EF+CKABCDEF-千層塔TAA+B+D-E+F+CKAABC+D+F護(hù)脖香TAB+C+D+E+F+CKABCDEF延曬9號(hào)TAB-CD-EF-CKAB-C-D-E-E+自來(lái)紅TAB+CD+E+F+CKABC-DEF建平大蘭花TAC-DEFF+CKAB+C+DEF

注：T表示處理，CK為對(duì)照；其中，A～F代表煙草花芽分化的6個(gè)階段；-代表未超過(guò)；+代表超過(guò)；下同。

圖2 苗期進(jìn)行低溫誘導(dǎo)的延曬9號(hào)花芽分化進(jìn)程

圖3 苗期未進(jìn)行低溫誘導(dǎo)的延曬9號(hào)花芽分化進(jìn)程

2.1.2.2 低溫處理對(duì)烤煙花芽分化進(jìn)程的影響

低溫處理對(duì)18份烤煙品種花芽分化進(jìn)程的影響(表3)表明，低溫處理組(T)的花芽分化進(jìn)程均較對(duì)照組(CK)提前。以NC82號(hào)為例(圖4，5)，進(jìn)行低溫處理的花芽分化開(kāi)始是在移栽后30 d，花芽分化基本結(jié)束在移栽后51 d；而未進(jìn)行低溫處理的在移栽后34 d花芽開(kāi)始分化，移栽后55 d花芽分化基本結(jié)束。NC82的低溫處理與未處理相比，花芽分化進(jìn)程整體提前4 d左右。

表3 低溫處理對(duì)不同烤煙品種花芽分化的影響

圖4 苗期進(jìn)行低溫誘導(dǎo)的NC82花芽分化進(jìn)程

圖5 苗期未進(jìn)行低溫誘導(dǎo)的NC82花芽分化進(jìn)程

2.2 25份煙草品種(系)聚類(lèi)分析結(jié)果

相對(duì)早花指數(shù)(A)及相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(B)的聚類(lèi)分析列于圖6，結(jié)果顯示，無(wú)論是基于相對(duì)早花指數(shù)還是相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)的聚類(lèi)分析，均將25份煙草品種劃分為2大類(lèi)群，耐早花品種類(lèi)群(I)和易早花品種類(lèi)群(II)2大類(lèi)。其中，耐早花品種類(lèi)群(I)包含2個(gè)亞類(lèi)群(I-1、I-2)：I-1(耐早花品種亞類(lèi)群)包含4個(gè)品種，分別為龍江981、K326、延曬9號(hào)、CV91。I-2(較耐早花品種亞類(lèi)群)在A和B 2個(gè)聚類(lèi)中略有差異，基于A的聚類(lèi)分析中I-2(較耐早花品種亞類(lèi)群)包含9份品種，分別為吉煙9號(hào)、延吉千層塔、自來(lái)紅、8107、CF222、9407、白城護(hù)脖香、CF205、CF209；基于B的聚類(lèi)分析中I-2(較耐早花品種亞類(lèi)群)包含8個(gè)品種，分別為吉煙9號(hào)、9407、CF222、CF209、8107、筑波一號(hào)、白城護(hù)脖香、小黃煙。易早花品種類(lèi)群(II)也包含2個(gè)亞類(lèi)群(II-1、II-2)，II-1(較易早花品種亞類(lèi)群)在A和B 2個(gè)聚類(lèi)中也略有差異，基于A聚類(lèi)中，II-1(較易早花品種亞類(lèi)群)包含的9個(gè)品種為筑波一號(hào)、溫德?tīng)?、小黃煙、云煙119、韓國(guó)一號(hào)、小碼稀、云煙87、安南、宣洞區(qū)；基于B聚類(lèi)中，II-1(較易早花品種亞類(lèi)群)包含的10個(gè)品種為CF205、延吉千層塔、自來(lái)紅、溫德?tīng)?、安南、云?7、韓國(guó)一號(hào)、小碼稀、云煙119、宣洞區(qū)；II-2(極易早花品種亞類(lèi)群)共包含3個(gè)品種為，NC82、建平大蘭花、NC89。

圖6 基于相對(duì)早花指數(shù)(A)及相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(B)的聚類(lèi)類(lèi)群

2.3 25份煙草品種(系)低溫誘導(dǎo)早花耐易性鑒定結(jié)果

25份參試品種相對(duì)早花指數(shù)調(diào)查結(jié)果列于表4，人工鑒定結(jié)果共分為4個(gè)等級(jí)：1) 耐低溫早花品種—簡(jiǎn)稱(chēng)耐早花(R)，其相對(duì)早花指數(shù)范圍分布在1.0%～6.0%，共有4份煙草品種，分別為龍江981、CV91、K326及延曬9號(hào)；2) 較耐低溫早花品種—簡(jiǎn)稱(chēng)較耐早花(MR)，相對(duì)早花指數(shù)分布范圍在6.0%～10.0%，共計(jì)9份煙草品種，分別是吉煙9號(hào)、延吉千層塔、自來(lái)紅、8107、CF222、9407、白城護(hù)脖香、CF205、CF209；3) 較易低溫早花品種—簡(jiǎn)稱(chēng)較易早花(ME)，相對(duì)早花指數(shù)分布范圍在10.0%～16.0%，共9份品種，分別為筑波一號(hào)、溫德?tīng)?、小黃煙、云煙119、韓國(guó)一號(hào)、小碼稀、云煙87、安南、宣洞區(qū)；4) 極易低溫早花品種—簡(jiǎn)稱(chēng)易早花(E)，相對(duì)早花指數(shù)在16.0%以上，共計(jì)3份煙草品種，分別是NC89、建平大蘭花及NC82。說(shuō)明不同煙草品種間的相對(duì)早花指數(shù)存在差異及低溫誘導(dǎo)對(duì)各品種煙草早花程度存在不同差異性。

表4 25份煙草品種(系)相對(duì)早花指數(shù)調(diào)查及鑒定結(jié)果

不同參試品種相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)的調(diào)查結(jié)果(表5)表明，K326、龍江981、延曬9號(hào)、CV91，4份煙草品種的相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)均<7.5%，為耐早花品種。吉煙9號(hào)、9407、CF222、CF209、8107、筑波一號(hào)、白城護(hù)脖香、小黃煙，8份煙草品種的相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)均在7.5%～15.0%，為較耐早花品種。CF205、延吉千層塔、自來(lái)紅、溫德?tīng)?、安南、云?7、韓國(guó)一號(hào)、小碼稀、云煙119、宣洞區(qū)，10份煙草品種的相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)均在15.0%～27.0%，為較易早花品種。NC89、建平大蘭花及NC82，這3份品種的相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)均>27.0%，為極易早花品種。

表5 25份煙草品種(系)相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)調(diào)查及鑒定結(jié)果Table 5 Investigation and identification of relative leaf number reduction index of 25 tobacco varieties(lines)

2.4 25份煙草品種(系)的耐易性

25份參試品種差異顯著性分析結(jié)果列于表6，2大類(lèi)群間的相對(duì)早花指數(shù)(A)和相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(B)均存在極顯著差異(P<0.01)，每個(gè)亞類(lèi)群之間(I-1、I-2、II-1、II-2)相對(duì)早花指數(shù)(A)和相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(B)也都存在顯著性差異(P<0.05)。由此可見(jiàn)，無(wú)論是基于A指數(shù)還是B指數(shù)上，通過(guò)系統(tǒng)聚類(lèi)均能將25份煙草品種對(duì)低溫誘導(dǎo)早花的耐易性進(jìn)行有效的分類(lèi)。

在I和II 2個(gè)大類(lèi)群中，I類(lèi)群的相對(duì)早花指數(shù)(均值7.52%±0.25%，變幅4.11%～9.69%)和相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(均值10.58%±1.45%，變幅3.98%～14.49%)與II類(lèi)群的相對(duì)早花指數(shù)(均值15.68%±0.26%，變幅14.2%～17.7%)和相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(均值25.53%±1.61%，變幅17.24%～32.41%)存在極顯著差異(P<0.01)。A指數(shù)與B指數(shù)的不同亞類(lèi)群之間(I-1、I-2、II-1、II-2)也均存在顯著性差異(P<0.05)。說(shuō)明基于相對(duì)早花指數(shù)(A)和相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(B)的聚類(lèi)法劃分25個(gè)煙草品種的早花耐易性結(jié)果基本一致。

表6 基于相對(duì)早花指數(shù)(A)及相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(B)類(lèi)群對(duì)低溫誘導(dǎo)早花的耐易性

注：不同小寫(xiě)字母代表在處理間顯著差異水平(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母代表在處理間差異極顯著水平(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

3.1 25份煙草品種(系)苗期低溫誘導(dǎo)早花聚類(lèi)分析

聚類(lèi)分析是對(duì)數(shù)理性質(zhì)上相似的對(duì)象進(jìn)行歸類(lèi)劃分[13-15]，將不同集合的抽象對(duì)象按其性質(zhì)劃分為多個(gè)組別的過(guò)程[16-17]。通過(guò)物以類(lèi)聚的原理將數(shù)據(jù)分為不同的類(lèi)群及亞類(lèi)群，將不同相似性的對(duì)象歸納進(jìn)一個(gè)組內(nèi)更加直觀明了便于觀察，采用聚類(lèi)分析對(duì)低溫誘導(dǎo)早花耐易性劃分結(jié)果更為可靠。本試驗(yàn)，首次采用相對(duì)早花指數(shù)(RE)和相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(RL)衡量不同品種(系)煙草低溫誘導(dǎo)早花的耐易性及分類(lèi)，無(wú)論是基于RE還是RL進(jìn)行聚類(lèi)都將25份煙草品種分為耐早花品種和易早花品種2大類(lèi)群，其中耐早花品種類(lèi)群(I)包括2個(gè)亞類(lèi)群：I-1(耐早花品種亞類(lèi)群)、I-2(較耐早花品種亞類(lèi)群)；易早花品種類(lèi)群(II)也包含2個(gè)亞類(lèi)群(II-1、II-2)，II-1(較易早花品種亞類(lèi)群)、II-2(極易早花品種亞類(lèi)群)；以RE和RL 2個(gè)指標(biāo)分別進(jìn)行聚類(lèi)分析結(jié)果顯示：II-1、I-2亞群間略有差異，但各類(lèi)群品種劃分大體相同。耐早花與易早花2大類(lèi)群間都存在極顯著差異，且4個(gè)亞類(lèi)群間均有顯著差異。

3.2 25份煙草品種(系)苗期低溫誘導(dǎo)早花耐易性鑒定

煙草是以收獲葉片為主的經(jīng)濟(jì)作物，受早花影響的煙株較正常生長(zhǎng)的煙株矮小，葉數(shù)銳減，且葉片窄而小，提前達(dá)到現(xiàn)蕾期，這極大影響了煙草的產(chǎn)量進(jìn)而造成經(jīng)濟(jì)損失[1]。本試驗(yàn)移栽后不同品種低溫處理組較對(duì)照均相對(duì)矮小，且通過(guò)體視顯微鏡觀察，低溫處理花芽分化進(jìn)程較對(duì)照均提前，低溫處理時(shí)間越長(zhǎng)，進(jìn)入花芽分化階段越早，早花現(xiàn)象越明顯，這與前人[18-20]對(duì)低溫誘導(dǎo)早花研究結(jié)果相吻合。

通過(guò)調(diào)查不同煙草品種移栽后低溫處理組和對(duì)照組達(dá)到現(xiàn)蕾期天數(shù)及田間有效葉數(shù)的調(diào)查，并結(jié)合各品種處理及對(duì)照進(jìn)入花芽分化各個(gè)階段的時(shí)間計(jì)算出RE和RL來(lái)判斷對(duì)早花的耐易性，結(jié)果表明：龍江981、CV91、K326及延曬9號(hào)，4份煙草品種低溫處理與對(duì)照相比現(xiàn)蕾期提前1 d左右，相對(duì)早花指數(shù)為1.0%～6.0%，為耐早花品種；吉煙9號(hào)、延吉千層塔、自來(lái)紅、8107、CF222、9407、白城護(hù)脖香、CF205、CF209，9份煙草品種低溫處理較對(duì)照現(xiàn)蕾期提前2～3 d，相對(duì)早花指數(shù)均在6.0%～10.0%，為較耐早花品種；筑波一號(hào)、溫德?tīng)?、小黃煙、云煙119、韓國(guó)一號(hào)、小碼稀、云煙87、安南、宣洞區(qū)，9份品種低溫處理較對(duì)照現(xiàn)蕾期提前3～4 d，相對(duì)早花指數(shù)在10.0%～16.0%，為較易早花品種；NC89、建平大蘭花及NC82，3份品種低溫處理較對(duì)照現(xiàn)蕾期均提前4 d以上，相對(duì)早花指數(shù)為16.0%以上，為極易早花品種。由此可見(jiàn)，基于相對(duì)早花指數(shù)(RE)和相對(duì)葉數(shù)減少指數(shù)(RL)對(duì)25份煙草品種苗期低溫誘導(dǎo)早花聚類(lèi)分析的耐易性鑒定結(jié)果可靠，為今后優(yōu)良品種的選育和耐低溫早花基因的挖掘奠定基礎(chǔ)。