易袁晶 魏雪利 馬明明

劉寶瓊△ 胡治平** 肖波△ 曾藝*○☆

研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)沙地區(qū)腦出血年平均發(fā)病率為131.0/10萬(wàn)，腦出血占腦卒中的比例為55.4%，遠(yuǎn)高于世界平均水平，其中79.8%腦出血患者患有高血壓病[1]。在長(zhǎng)沙漢族人群研究中，證實(shí)遺傳因素與腦出血發(fā)病有關(guān)[2-4]。近期研究表明，腦出血急性期人體ET-1血漿水平升高，且與顱內(nèi)血腫大小成正相關(guān)[5]，提示ET-1可能參與腦出血的發(fā)病。ET-1基因單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphisms,SNPs）已被證實(shí)參與了包括高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化在內(nèi)的多種人體疾病發(fā)生、發(fā)展的病理過程[6]。本研究擬利用長(zhǎng)沙漢族人群研究ET-1基因兩個(gè)常見 SNPs（rs5370、rs1800541）與腦出血的關(guān)系，并探討對(duì)其血壓的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2006年1月至2009年12月于湘雅醫(yī)院就診的腦出血患者作為研究對(duì)象，收集其臨床資料和外周血標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②湖南省長(zhǎng)沙地區(qū)漢族人；③頭顱CT平掃和/或頭顱MRI平掃證實(shí)為急性腦出血，且符合第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；④發(fā)病至住院時(shí)間≥14 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：①外傷、藥物、動(dòng)脈炎、腫瘤、腦血管畸形或動(dòng)脈瘤引起的腦出血病例；②混合型腦血管?。üＫ篮蟪鲅虺鲅蠊Ｋ溃┑牟±虎鄹文I功能障礙、血液病及溶栓治療接受者、甲狀腺疾病、自身免疫型疾病及妊娠者。

隨機(jī)選取同期在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院的健康體檢人員作為對(duì)照組，收集其臨床資料和外周血標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②湖南省長(zhǎng)沙地區(qū)漢族人。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腦血管病、血液病、肝腎疾病、甲狀腺疾病、自身免疫性疾病、及妊娠者；②無腦血管病家族史。

腦出血組、對(duì)照組成員均無血緣關(guān)系，并簽署知情同意書。研究方案通過醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清標(biāo)本的采集研究對(duì)象禁食12 h，次日清晨7時(shí)至 8時(shí)采外周靜脈血 10 mL，取 5 mL（不抗凝）靜置 1 h，2000 r/min常溫離心后分離血清，將血清置于4℃冰箱保存，用于血脂測(cè)定，其余5 mL（肝素抗凝）用于DNA制備。

1.3 收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓的測(cè)定測(cè)量腦出血患者入院時(shí)、發(fā)病1周后和發(fā)病2周后血壓，3次血壓均超過140 mmHg/90 mmHg、發(fā)病之前確診過高血壓病或者口服高血壓藥物者診斷為臨床高血壓病。將腦水腫高峰期前或者高峰期過后的血壓水平進(jìn)行記錄。

1.4 基因分型利用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。用于擴(kuò)增ET-1基因兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的PCR引物序列經(jīng)Primer 3.0設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成。引物序列：rs5370F AAGAGTTGCGGCGGGTGGT，rs5370R AATGTGCTCGGTTGTGGGTCA；rs1800541F GGCATCCCCTGGGAAGAGA CT，rs1800541R TGCATGGAACACATTGGCTTTT。 PCR 反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性 15 min；96 ℃ 10 s，50℃ 5 s，60 ℃ 30 s，28個(gè)循環(huán)；60℃延伸1 min。根據(jù)美國(guó)ABI公司的操作說明采用SAP/ExoⅠ酶法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。根據(jù)SNP上游序列，使用Primer 3.0設(shè)計(jì)ET-1基因兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的單堿基延伸引物。延伸引物序列：rs5370SF TTTTATCCCAAGCTGAAAGGCAA，rs1800541SR TTTTTTTTTTTTTGA ATTTTTGTTTGTTCTCCACCA。延伸反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性1 min；96℃變性 10 s，50℃退火 5 s，60 ℃延伸 30 s，28個(gè)循環(huán)；60℃延伸1 min。延伸產(chǎn)物純化：在10 μL延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶，37℃溫浴 1 h，然后75℃滅活15 min。純化后的延伸產(chǎn)物在ABI 3130XL測(cè)序儀上樣。收集ABI 3130XL測(cè)序儀上的原始數(shù)據(jù)，用GeneMapper 4.0進(jìn)行SNP信息分析。選取有代表性的樣本對(duì)每種基因型測(cè)序，在SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，按Hardy-Weinberg平衡法檢驗(yàn)群體代表性。對(duì)腦出血與正常對(duì)照組兩組間基因型和等位基因的頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，血壓水平和不同基因型亞組間血壓比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況共納入腦出血患者195例，男133例，女62

例，平均(55.40±11.21)歲；對(duì)照組 116例，男 41例，女 75例，平均(54.97±10.41)歲。兩組在年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙史方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腦出血組冠心病史、高血壓病史和糖尿病史均高于對(duì)照組（P＜0.05）。血壓水平比較，腦出血組的平均動(dòng)脈壓顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。血脂水平比較，腦出血組甘油三脂和高密度脂蛋白膽固醇水平（HDL-C）顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)分布116例健康對(duì)照中，成功分型出114例，陽(yáng)性檢出率＞95%。各SNPs的基因型及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)沙地區(qū)漢族人群中，ET-1基因rs5370多態(tài)有GG、GT、TT三種基因型，ET-1基因rs1800541多態(tài)有 TT、TG、GG三種基因型。選取具代表性樣本進(jìn)行直接測(cè)序，各位點(diǎn)基因型全部與測(cè)序結(jié)果吻合見（圖1）。通過查詢http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/中 dbSNP， 我們ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)的基因型及等位基因頻率及與其他人群比較結(jié)果見表 1、2，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)與腦出血的關(guān)系本研究195例腦出血患者中，成功分型出194例，陽(yáng)性檢出率＞95%。腦出血組與對(duì)照組的ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)基因型及等位基因頻率比較見表3。腦出血組與對(duì)照組ET-1基因rs5370、rs1800541基因型及等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)性與腦出血的易感性之間無明顯相關(guān)性。

2.4ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)對(duì)血壓的影響腦出血組與對(duì)照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)不同基因型對(duì)收縮壓 (systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)和平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure,MAP)的影響見表4。腦出血組及對(duì)照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)各基因型亞組間 SBP、DBP和 MAP水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

3 討論

內(nèi)皮素-1（endothelin-1,ET-1）是內(nèi)皮素家族的主要成員，也是人體內(nèi)內(nèi)皮素的主要存在形式，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌[8]，能通過長(zhǎng)程收縮血管導(dǎo)致血壓升高，現(xiàn)已被認(rèn)為是高血壓的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素[6]。高血壓是腦出血的主要病因。趙永波等[9]發(fā)現(xiàn)ET-1可能為高血壓及高血壓性腦出血的共同危險(xiǎn)因素，并參與、影響高血壓性腦出血的病理生理過程。武婕等[10]研究表明血漿ET水平的升高程度與腦出血量有一定關(guān)系。ET-1的血漿水平及其生物學(xué)活性均主要由ET-1基因調(diào)控[6]。

表1正常對(duì)照人群中rs5370多態(tài)分布及其他人群比較

圖1 ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)基因分型結(jié)果與測(cè)序圖。A～C為 ET-1基因rs5370多態(tài)位點(diǎn)的基因分型結(jié)果，分別代表GG、TT、GT基因型；D～F為 ET-1基因 rs1800541多態(tài)位點(diǎn)的基因分型結(jié)果，分別代表 TT、GG、TG基因型；G～I(xiàn)為 ET-1基因rs5370多態(tài)位點(diǎn)正向測(cè)序圖，分別代表GG、GT、TT基因型；J～L為 ET-1基因rs1800541多態(tài)位點(diǎn)反向測(cè)序圖，分別代表TT、TG、GG基因型

表2正常對(duì)照人群中rs1800541多態(tài)分布及其他人群比較

表4 腦出血組與對(duì)照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)對(duì)血壓的影響

ET-1基因rs5370多態(tài)一直是ET-1基因與疾病研究的主要目標(biāo)多態(tài)位點(diǎn)[11]。既往研究表明，ET-1基因rs5370等多態(tài)與普通人群高血壓病無關(guān)，僅與某些特殊人群（如肥胖患者、孕婦等）中的高血壓相相關(guān)[12-14]。有關(guān)rs5370與腦出血的相關(guān)性尚未見報(bào)導(dǎo)。PANOULAS等[15]發(fā)現(xiàn)ET-1基因rs1800541與rs5370多態(tài)構(gòu)成的單倍體（T-T）與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者ET-1血漿水平增高及其罹患高血壓 （舒張壓升高為主）的風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)。因此，我們的研究特意選擇了ET-1基因rs5370多態(tài)及與rs5370多態(tài)在同一染色體上并位置鄰近的ET-1基因rs1800541多態(tài)作為候選位點(diǎn)。研究結(jié)果顯示長(zhǎng)沙地區(qū)漢族人群中，腦出血ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)基因型及等位基因頻率分布與對(duì)照組比較均無顯著性差異，提示ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)可能與腦出血的發(fā)病無關(guān)。我們加做了其單體型與腦出血的關(guān)系研究，但仍未得到陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。

本研究顯示對(duì)照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)基因型亞組間的血壓水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），與既往研究結(jié)果相符。本研究顯示腦出血組的平均動(dòng)脈壓顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05），但腦出血組ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)基因型亞組間的血壓水平無顯著性差異（P＞0.05）， 提示ET-1基因 rs5370、rs1800541 多態(tài)可能不是影響腦出血患者血壓水平的重要因素。

綜上所述，在長(zhǎng)沙漢族人群中，采用病例-對(duì)照法對(duì)ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)與腦出血的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果提示ET-1基因rs5370、rs1800541單核苷酸多態(tài)可能與腦出血的發(fā)病無關(guān)，并可能不是影響其血壓水平的重要因素。但腦出血是一種多基因復(fù)雜性狀疾病，其遺傳模式復(fù)雜、未知，加上遺傳異質(zhì)性、表型異質(zhì)性及各種環(huán)境因素的影響，仍須在不同種族、地域人群中進(jìn)行更大樣本量的研究，以進(jìn)一步明確ET-1基因rs5370、rs1800541多態(tài)與腦出血的關(guān)系。