呂潔 蔣曉山 譚超 張晶 彭湘暉 林紅梅

NLRP3炎癥小體是由NLRP3、接頭蛋白凋亡相關(guān)微粒蛋白 （apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）、 效應(yīng)蛋白 Procaspase-1和銜接蛋白胱天蛋白酶募集域蛋白8（caspase recruitment domain-containing protein 8，CARD8）組成的一種大分子多蛋白復(fù)合體。研究證明，NLRP3炎癥小體的激活在缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，成為炎癥級聯(lián)反應(yīng)關(guān)鍵的分子通路，而通過調(diào)控NLRP3炎癥小體的活性可保護神經(jīng)功能，改善預(yù)后[1-2]。至目前為止，國內(nèi)外關(guān)于NLRP3炎癥小體組分基因的多態(tài)性與IS的關(guān)聯(lián)研究僅有兩項[3-4]，且均是針對單一組分基因的研究，故本研究采用TaqManMGB RT-PCR技術(shù)進行基因分型，分析NLRP3炎癥小體組分基因的多態(tài)性CARD8 rs2043211及NLRP3 rs10754558在IS亞型發(fā)病風險中的共關(guān)聯(lián)作用，以期為IS的篩查、預(yù)防以及生物治療靶點的開發(fā)提供新的理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象采用病例對照研究方法，病例組選擇于2015～2017年在廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的病程1周內(nèi)的急性IS病例并連續(xù)入組，納入標準：①符合中國急性缺血性腦卒中診治指南 2018的診斷標準[5]：a.急性起病；b.局灶神經(jīng)功能缺損；c.影像學(xué)出現(xiàn)責任病灶或癥狀體征持續(xù)24 h以上；②年齡18～85歲；③中國南方漢族人群；④排除腦外傷、腦腫瘤、已知的單基因腦血管病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、腦出血、短暫腦缺血發(fā)作及與自身免疫或炎癥相關(guān)的疾病。依據(jù)改良的TOAST病因分型診斷標準[6]，將AT型（n=145）及SAD型（n=89）IS納入本研究。對照組采用調(diào)查問卷的形式收集與病例組相匹配的來自健康體檢中心的人群，除了無腦梗死病史外，均符合上述納入標準。所有研究對象均已簽署知情同意。本研究已獲得我院倫理委員會的批準 （倫理編號：2017NXSYYEC-022）。

1.2 標本采集病例組于入院當天，對照組于體檢當天取肘靜脈血2 mL置于EDTA抗凝管中，采用全血DNA快速提取試劑盒（購于深圳亞能生物技術(shù)有限公司）提取基因組DNA。

1.3 基因分型采用TaqMan MGB實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)在LightCycler 480 II（Roche，瑞士）熒光定量PCR儀上進行CARD8 rs2043211、NLRP3 rs10754558的基因分型 （引物序列見表 1）。 PCR 反應(yīng)體系（10 μL）為：2×Taq-Man Fast qPCR Master Mix 5 μL，10μmol/L For wardPrimer0.25μL，10μmol/L ReversePrimer0.25μL，10 μmol/L probe 0.2+0.2 μL，dd H2O 3.1 μL，Template DNA 1.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃×4 min～（95 ℃×7 s～60 ℃×40 s～72 ℃×1 s）×40 個循環(huán)。每個96孔板設(shè)置兩個空白對照。應(yīng)用LightCycler 480 Software 1.5分析分型結(jié)果。隨機挑選10%的樣本，利用第一代測序法對基因分型的準確性進行驗證，結(jié)果一致率為100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法通過Haploview 4.2檢驗研究樣本對照組是否符合Hardy-Weinberg平衡，采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。分別用t檢驗、方差分析和χ2檢驗對計量資料和分類資料進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，以非條件logistic回歸模型計算比值比（OR）、95%可信區(qū)間（CI）、SNP與環(huán)境因素的交互作用、單一基因與疾病的交互作用、基因與基因的交互作用。以上所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗CARD8 rs2043211與NLRP3 rs10754558在對照組中的基因型頻率分布均符合 Hardy-Weinberg平衡（rs10754558：χ2=1.98，P=0.16；rs2043211：χ2=0.27，P=0.60）。

2.2 一般情況性別、民族、吸煙狀況、HDL-C、高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q

冠）情況在AT組、SAD組和對照組中的分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.001 或P＜0.05）；HsCRP 在對照組中未檢測，但在AT組和SAD組中的水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（見表 2）。

2.3 SNP-臨床指標交互作用在AT組與對照組的比較中，rs10754558分別與吸煙、高血壓、冠心病的交互作用升高發(fā)病風險；rs2043211與HDL-C的交互作用降低發(fā)病風險，與吸煙、高血壓、冠心病的交互作用升高發(fā)病風險。在SAD組與對照組的比較中，rs10754558與高血壓存在交互作用，rs2043211與吸煙、高血壓存在交互作用，均升高發(fā)病風險（見表3）。

2.4 SNP與缺血性腦卒中的關(guān)聯(lián)分析rs10754558和rs2043211的小等位基因頻率（MAF）及不同遺傳模式下的基因型頻率分布在AT組、SAD組分別與對照組的比較中其差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞

0.05）（見表 4）。

2.5 SNP-SNP交互作用如表 5所示，NLRP3 rs10754558或CARD8 rs2043211單一基因的多態(tài)性位點的基因型頻率分布，AT組、SAD組分別與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但是進行兩個基因多態(tài)性位點的交互作用分析時發(fā)現(xiàn)，AT組與對照組比較，rs10754558位點的CG基因型與rs2043211位點的AT基因型存在交互作用，且增加發(fā)病風險（P＜0.01）。

3 討論

NLRP3基因被廣泛研究的多態(tài)性位點是rs35829419（c.2113C＞A，p.Q705K）及rs10754558，均為“功能獲得性的”突變[7]。人類NLRP3 rs10754558位點位于NLRP3基因的3‘UTR中，其小等位基因G可導(dǎo)致NLRP3mRNA表達的增高[7]。CARD8基因功能性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs2043211（c.30T＞A，p.C10X）位于CARD8基因第五個外顯子內(nèi)，是CARD8基因模版鏈上A堿基到T堿基的改變。許多學(xué)者已對上述NLRP3炎癥小體單一組分基因的多態(tài)性對眾多慢性炎癥性疾病易感性的影響進行了關(guān)聯(lián)研究[8-11]，然而結(jié)論是相互矛盾的，這種矛盾可能緣于炎癥小體復(fù)合物其他組分基因SNP的存在[12]。

表1 CARD8 rs2043211和NLRP3 rs10754558基因分型的引物序列

表2缺血性腦梗死病例組和對照組的一般情況

表3 SNP-臨床指標交互作用

表4 SNP與缺血性腦卒中的小等位基因及基因型關(guān)聯(lián)分析

表5 SNP-SNP交互作用

我們的研究并沒有發(fā)現(xiàn)NLRP3 rs10754558或CARD8 rs2043211單一基因的SNP與IS兩個亞型有任何關(guān)聯(lián)作用，這與2014年BAI[3]及2015年ZHU[4]的研究結(jié)果矛盾，他們的研究發(fā)現(xiàn)CARD8 rs2043211的小等位T在隱性遺傳模式下降低IS發(fā)生的風險[3]、NLRP3 rs10754558位點的小等位基因 G顯著增高IS進展的風險[4]，上述兩項研究均為針對NLRP3炎癥小體單一組分基因多態(tài)性的分析。我們認為結(jié)論矛盾可能緣于：在研究NLRP3炎癥小體這一多蛋白復(fù)合物時，孤立研究單一組份基因的多態(tài)性難以全面而客觀地反映NLRP3炎癥小體在免疫炎癥機制中的遺傳學(xué)效應(yīng)，尤其是對于IS這一典型的由多基因控制、表型呈間斷分布的復(fù)雜性疾病來說。而探索多位點基因型組合與某一疾病的關(guān)聯(lián)的研究方興未艾，但也僅限于NL RP3的另一個SNP rs35829419與CARD8 rs2043211的交互作用分析，在缺血性腦血管病這一領(lǐng)域，相關(guān)研究尚未開展。

因此，在本研究中我們對基因間的交互作用也進行了分析，發(fā)現(xiàn)基因型組合CARD8 rs2043211/NLRP3 rs10754558AT/CG顯著增加AT型IS的患病風險，在SAD型IS中并未發(fā)現(xiàn)此種關(guān)聯(lián)，這與以往研究所發(fā)現(xiàn)的與其他慢性炎癥性疾病相關(guān)聯(lián)的基因型組合不同，且所探討的NLRP3的SNP位點不同。RBOERTS等分別在對腹主動脈瘤[13]和克羅恩?。–rohn’s disease，CD）[14]的研究中發(fā)現(xiàn)：CARD8 rs2043211和NLRP3 rs35829419存在顯著相關(guān)，當一個SNP的次等位基因和另一個SNP的野生純合型共同存在時對疾病具有保護效應(yīng)。我們的研究并未發(fā)現(xiàn)一個SNP的次等位基因和另一個SNP的野生純合型共同存在時（rs2043211/rs10754558AA/CG、AA/GG、AT/CC、TT/CC）對 IS的保護作用，但也并未增加疾病風險，這可能與本研究中的樣本量偏少有關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)均可用NLRP3和CARD8的生物學(xué)特性來解釋：當配體與NLRP3蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域結(jié)合后NLRP3被活化，通過PYD-PYD相互作用與ASC結(jié)合，由ASC的CARD結(jié)構(gòu)域招募Pro-caspase-1形成炎癥小體，并自身激活，活化后的caspase-1對Pro-IL-1β和Pro-IL-18等底物進行切割，最終促進先天免疫中極為重要的炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-18的成熟及分泌，從而廣泛參與缺血性腦損傷的全過程[15]。近來的研究表明，CARD8是通過FIIND結(jié)構(gòu)域與NLRP3的NOD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合抑制NLRP3的寡聚化來反向調(diào)控內(nèi)源性NLRP3炎癥小體活性的[16]；另一方面，CARD8可以負向調(diào)控 NF-κB的激活，并同時擁有抗凋亡的能力[17-18]。CARD8 rs2043211的小等位基因形成終止密碼（Cys10Stop）并導(dǎo)致產(chǎn)生截斷蛋白，從而失去了抑制NF-κB活性的能力，引致作為NLRP3炎癥小體底物的Pro-IL-1β的過多產(chǎn)生[19]。但如果沒有NLRP3 rs35829419“功能獲得性”的小等位基因的存在，Pro-IL-1β將不會被轉(zhuǎn)化為過多、成熟的IL-1β，反之亦然[14]。因此上述的基因型組合并不增加患病風險。

不同于上述研究分析兩個基因所有的基因型組合，有些學(xué)者將研究群體根據(jù)兩個基因均不存在變異的等位基因（即均為野生純合型，C10X/Q705K+/+）和兩個基因均至少存在一個變異的等位基因（C10X/Q705K-/-）劃分，KASTBOM 等[20]發(fā)現(xiàn)攜帶C10X/Q705K-/-的類風濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）的患者具有更高的疾病活性和更高的接納TNF阻滯治療的可能性，上述發(fā)現(xiàn)在男性CD患者中被進一步印證[21]。2015年KASTBOM等[22]進一步的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶基因型組合C10X/Q705K-/-的RA患者罹患卒中和短暫性腦缺血發(fā)作的風險增加。我們的研究發(fā)現(xiàn)，rs2043211/rs10754558-/-（TT/CG、TT/GG、AT/GG、AT/CG）中AT/CG基因型組合顯著增加IS的患病風險，這與上述研究結(jié)果相吻合，提示了CARD8的SNPrs2043211只有在與NLRP3的 “功能獲得性”SNP共同存在時才能激活炎癥小體，生成更多的成熟的IL-1β，因此增加疾病的發(fā)病風險。

但我們也看到，rs2043211/rs10754558的 TT/CG、TT/GG基因型組合與IS的易患性也無關(guān)，且至目前為止，在CARD8和NLRP3基因多態(tài)性的組合效應(yīng)的研究中仍然存在矛盾性的結(jié)論，一些研究也并未觀察到NLRP3 Q705K和CARD8 C10X的交互作用對RA的易感性有任何影響[23]，這些陰性的結(jié)果可能是因為大多數(shù)攜帶CARD8C10X的患者是在C10X位點的下游啟動了CARD8亞型（T47）的轉(zhuǎn)錄，所以仍繼續(xù)表達一個略小然而功能完備的CARD8[24]，而攜帶C10X純合型的患者可能會因為T47亞型而具備功能性的CARD88蛋白[25]，而非截斷蛋白，因此進一步研究已鑒定出的CARD8亞型的功能以評估其抑制NF-κB活性的能力是很重要的。

同時我們的實驗亦證實了AT組較SAD組有更高的HsCRP水平，提示AT組可能存在的免疫炎癥反應(yīng)機制。在此，我們推測，NLRP3炎癥小體組分基因多態(tài)性的組合對IS的遺傳易患模型：即攜帶CARD8 rs2043211和NLRP3 rs10754558均為雜合子的人群更易罹患AT型腦梗死。而臨床上AT型較SAD型IS具有更嚴重的癥狀和更兇險的預(yù)后，因此，此基因型組合可幫助我們鑒定出潛在的對靶向治療IL-1β信號通路有效的AT型IS患者，減輕癥狀并改善預(yù)后。

鑒于本研究樣本量的局限及研究的SNP位點數(shù)量的局限，還需要具有更多樣本量、分析NLRP3炎癥小體組分基因更多SNP位點間交互作用的多中心研究進一步闡明多位點的基因型組合與IS發(fā)病間的共關(guān)聯(lián)作用，這些研究的進行將有助于開發(fā)新的預(yù)測、預(yù)防和治療缺血性腦血管病、自身免疫性疾病等與炎癥相關(guān)疾病的有力策略。