楊卓 王新軍○☆ 付旭東 曾凡濤 王修成 周少龍 張旭陽

基礎(chǔ)領(lǐng)域針對膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物的研究，為膠質(zhì)瘤分子學(xué)機(jī)制、靶向藥物的研制提供了至關(guān)重要的理論基礎(chǔ)。異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)[1]對膠質(zhì)瘤的分級以及預(yù)后判斷有重要的意義。F框/WD-40域蛋白7（FBox and WD40 domain protein 7,Fbxw7）為一種重要的腫瘤抑制因子，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、癌變等過程[2]。既往有文獻(xiàn)報(bào)道其在膠質(zhì)瘤組織中的應(yīng)用價(jià)值[3]。針對上述兩種蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的潛在研究價(jià)值，我們通過免疫組織化學(xué)法，蛋白質(zhì)印記法檢測膠質(zhì)瘤組織中Fbxw7的表達(dá)與分布，并探討Fbxw7的表達(dá)與IDH1之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012年1月1日至2015年12月31日于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科治療的86例膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①由影像學(xué)、病理明確診斷為膠質(zhì)瘤；②初次發(fā)病，首次手術(shù)切除；③術(shù)前未接受放療，化療及其他治療；④無其他神經(jīng)系統(tǒng)疾患。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前發(fā)生腦疝、腫瘤卒中者；②術(shù)后隨訪期各種原因死亡者；③精神心理異常者。同時(shí)選取30例頭顱外傷去骨瓣內(nèi)減壓患者腦組織作為對照組。膠質(zhì)瘤WHOⅠ級10例，其中毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤8例，室管膜下巨細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤2例；Ⅱ級38例，Ⅲ級26例，其中少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤14例，間變性星形細(xì)胞瘤12例；Ⅳ級12例。對所有納入研究的患者進(jìn)行為期36個(gè)月的隨訪。本研究已告知患者家屬并取得知情同意。兔多克隆抗體Fbxw7購于Abcam公司 （貨號ab109617），兔多克隆抗體IDH1、鼠/兔通用型S-P超敏試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液、NC膜購于北京索萊寶科技有限公司，熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 Fbxw7、IDH1分布檢測86例標(biāo)本在離體后迅速經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。標(biāo)本做連續(xù)切片，置于防脫劑預(yù)處理后的載玻片上，滴加Fbxw7抗體4℃過夜，磷酸緩沖液（PBS）清洗后滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育20min,PBS清洗加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15min，DAB顯色液顯色，沖洗，蘇木精復(fù)染等后于顯微鏡下觀察。選擇每張切片免疫反應(yīng)較強(qiáng)的區(qū)域，高倍鏡視野（×400）觀察5個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)Fbxw7陽性細(xì)胞，IDH1蛋白免疫組化按照同樣類似方法進(jìn)行。其中：陽性細(xì)胞百分比≤25%為1分，≤50%為2分，≤75%為3分，＞75%為 4分；根據(jù)染色程度評分：無染色者為0分，淡黃色者為1分，黃色或棕褐色者為2分，褐色者為3分。最后以兩者評分的總和為最終評分，0分為陰性，1～7分為陽性，其中1～3分為低表達(dá)，4～7分為高表達(dá)。

1.3 Fbxw7、IDH1蛋白印跡檢測用剪刀剪取少許新鮮冰凍組織并將其剪碎后置入1.5 mL EP管中，加RIPA裂解液至0.5 mL，充分溶解離心后提取上清。根據(jù)BCA顯色法，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出系數(shù)R2=0.995，估算出蛋白濃度。加入4×loading buffer，保證蛋白濃度5 mg/mL左右，煮沸后備用。配置12%分離膠，5%濃縮膠，按照電泳、轉(zhuǎn)NC膜、一抗孵育、過夜后二抗孵育、顯色、曝光，得出蛋白條帶。過程中嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，免疫組化中腫瘤組織與對照組織，低病理級別（Ⅰ、Ⅱ級）與高病理級別（Ⅲ、Ⅳ級）組織中Fbxw7、IDH1的表達(dá)采用單因素χ2檢驗(yàn)，蛋白印記中蛋白表達(dá)差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；Fbxw7蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用單因素 χ2檢驗(yàn)；Fbxw7與IDH1的表達(dá)相關(guān)性采用關(guān)聯(lián)系數(shù)r表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為 α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Fbxw7在腦組織中的表達(dá)Fbxw7蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)主要在胞漿中，可見黃色或棕黃色的顆粒物質(zhì)，其陽性表達(dá)率為83.72%，對照組中Fbxw7陽性表達(dá)率為46.67%，腫瘤組織中Fbxw7 的表達(dá)明顯高于對照組中（χ2=15.927，P＜0.01）；低病理級別腫瘤組織中Fbxw7蛋白的陽性表達(dá)率為93.75%，高病理級別組織中Fbxw7蛋白的陽性表達(dá)率為71.05%，低病理級別中Fbxw7蛋白陽性表達(dá)率明顯高于高病理級別組織，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.017，P＜0.01），見表 1，圖 1。

2.2 IDH1在腦組織中的表達(dá)IDH1在腫瘤組織胞核中呈現(xiàn)黃色或棕褐色的顆粒物質(zhì)，少量見于胞漿和胞膜中，其在腫瘤組織中陽性率為86.06%，對照組中陽性率為66.67%，腫瘤組織中IDH1的表達(dá)明顯高于對照組中 （χ2=5.435，P=0.023）；低病理級別腫瘤組織中IDH1蛋白的陽性表達(dá)率為79.17%，高病理級別組織中IDH1蛋白的陽性表達(dá)率為94.73%，高病理級別中IDH1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于低病理級別組織，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.282，P=0.036），見表 2，圖 2。

2.3 Fbxw7蛋白質(zhì)印記應(yīng)用Image Lab 5.2.1軟件，將實(shí)驗(yàn)標(biāo)本Fbxw7蛋白的光密度條帶與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶值進(jìn)行相比，所得值代表Fbxw7蛋白表達(dá)水平，對照組0.73±0.11，腫瘤組2.75±0.83,低級別 3.22±0.51，高級別 1.86±0.53，膠質(zhì)瘤組織中Fbxw7蛋白表達(dá)高于陰性對照組 （t=-13.251,P＜0.01），低病理級別中 Fbxw7蛋白表達(dá)水平較高病理級別組織明顯升高（t=10.445,P＜0.01）,見圖 3。

2.4 IDH1蛋白質(zhì)印記同樣的方法，所得值代表IDH1蛋白表達(dá)水平，對照組0.27±0.07，腫瘤組0.68±0.20,低級別 0.47±0.12，高級別 0.80±0.13，膠質(zhì)瘤組織中IDH1蛋白表達(dá)高于陰性對照組（t=-10.838,P＜0.01），高病理級別中 IDH1 蛋白表達(dá)水平較低病理級別組織明顯升高（t=-11.051,P＜0.01），見圖 3。

2.5 Fbxw7的表達(dá)與相關(guān)參數(shù)的關(guān)系腫瘤直徑、病理級別、癲癇發(fā)作情況、IDH1的表達(dá)影響Fbxw7的表達(dá)（P＜0.05），且 Fbxw7與 IDH1的表達(dá)相關(guān)性關(guān)聯(lián)系數(shù)r=0.51，而年齡，性別，頭暈病史、膠質(zhì)瘤細(xì)胞成分，術(shù)前KPS評分、腫瘤部位與Fbxw7 的表達(dá)無關(guān)(P＞0.05)，見表 3。

3 討論

腫瘤研究已逐漸轉(zhuǎn)化至基因水平、信號傳導(dǎo)通路。既往我們研究了膠質(zhì)瘤多個(gè)分子標(biāo)志物[4]，對膠質(zhì)瘤的基本生物學(xué)特征有了初步的了解。Fbxw7蛋白屬于F-box蛋白家族的一員，能特異性地識別和降解泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）中的底物蛋白，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、凋亡和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用，F(xiàn)bxw7突變和缺失可導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，加速癌細(xì)胞增殖相關(guān)基因的積累，如myc、cycline等[5]。最近的研究表明，F(xiàn)bxw7被認(rèn)為是一種針對各種致癌蛋白的腫瘤抑制因子，F(xiàn)bxw7基因突變和缺失能引起這些與癌細(xì)胞增殖相關(guān)基因的積累，且已經(jīng)在卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和膠質(zhì)瘤中被發(fā)現(xiàn)[6-7]。

圖1 膠質(zhì)瘤組織和對照組織中Fbxw7的表達(dá)（×400）。A：對照組織中Fbxw7的染色;B：膠質(zhì)瘤WHOⅠ級中Fbxw7的染色;C：膠質(zhì)瘤WHOⅡ級中Fbxw7的染色;D：膠質(zhì)瘤WHOⅢ級中Fbxw7的染色;E：膠質(zhì)瘤WHOⅣ級中Fbxw7的染色

圖2 膠質(zhì)瘤組織和對照組織中IDH1的表達(dá)（×400）。A：對照組織中IDH1的染色;B：膠質(zhì)瘤WHOⅠ級中IDH1的染色;C：膠質(zhì)瘤WHOⅡ級中IDH1的染色;D：膠質(zhì)瘤WHOⅢ級中IDH1的染色;E：膠質(zhì)瘤WHOⅣ級中IDH1的染色

圖3 蛋白印跡法檢測腦組織中Fbxw7、IDH1蛋白的表達(dá)水平。1：對照組織；2：膠質(zhì)瘤組織；3：低病理級別膠質(zhì)瘤組織；4：高病理級別膠質(zhì)瘤組織；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

表1 Fbxw7在不同組織中的表達(dá)差異

表2 IDH1在不同組織中的表達(dá)差異

本研究表明，Marker標(biāo)記Fbxw7的分子量約70kDa，在膠質(zhì)瘤組織中，低級別中陽性率明顯高于高級別陽性率，既往學(xué)者研究表明，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，F(xiàn)bxw7的表達(dá)顯著降低，且可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存標(biāo)志[3]，另有學(xué)者研究乳腺癌時(shí)稱Fbxw7蛋白在乳腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)水平下降[8]。上述結(jié)論與我們的研究結(jié)果基本符合，我們的猜測是：Fbxw7作為各種致癌蛋白的抑制因子，在低級別膠質(zhì)瘤中尚可發(fā)揮其抑制作用，表現(xiàn)出較高的陽性表達(dá)，然而在高級別膠質(zhì)瘤中，腫瘤高復(fù)雜性致使Fbxw7蛋白的功能受到更大程度的限制，其抑制能力顯著下降，表現(xiàn)為陽性表達(dá)逐漸下降，具體原因還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。既往對IDH1蛋白的研究已經(jīng)相當(dāng)深入，目前IDH1已被WHO作為膠質(zhì)瘤的分級指標(biāo)[9]，本研究中Marker標(biāo)記IDH1的分子量約45kDa,IDH1蛋白在膠質(zhì)瘤組織中明顯表達(dá)，且隨著膠質(zhì)瘤級別的升高而表達(dá)升高（P＜0.05），有文獻(xiàn)稱IDH1的不同程度表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度存在一定的相關(guān)性，且未處理的低級別膠質(zhì)瘤，極易轉(zhuǎn)變?yōu)槟z質(zhì)母細(xì)胞瘤[10]，因此IDH1用來研究膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特征，將有重要意義。本研究結(jié)果顯示Fbxw7蛋白的表達(dá)與IDH1 存在相關(guān)性（P＜0.05，r=0.51），且兩者在不同膠質(zhì)瘤級別的表達(dá)呈相反趨勢，是否存在相關(guān)上下游通路或拮抗關(guān)系尚不清楚。

表3 Fbxw7的表達(dá)與臨床病理參數(shù)分析（例）

腫瘤直徑直接反應(yīng)腫瘤體積大小，F(xiàn)bxw7蛋白與腫瘤直徑相關(guān)，可能是隨著腫瘤體積的增大，F(xiàn)bxw7蛋白功能受到影響所致。本研究顯示低級別腫瘤組織中Fbxw7蛋白的陽性率高于高病理級別陽性率，此結(jié)論于其他文獻(xiàn)也有類似報(bào)道[3]，可能是Fbxw7的生物功能受到更多的抑制，從而在高級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)下降，提高腫瘤復(fù)雜程度，增加治療難度，有研究顯示：Mir-223/Fbxw7通路是許多人類癌癥（如胃癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌）耐藥機(jī)制的重要線索[11]。因此，從Fbxw7入手，解決高級別膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率，提高化療藥物控制率，可能是潛在的突破口。癲癇的發(fā)生對于膠質(zhì)瘤本身而言，提高了膠質(zhì)瘤的檢出率，既往我們課題組已經(jīng)明確多個(gè)腫瘤標(biāo)志物與癲癇發(fā)作存在相關(guān)性[12]，本研究顯示Fbxw7與膠質(zhì)瘤中癲癇存在相關(guān)性，文獻(xiàn)報(bào)道癲癇多發(fā)生于低級別膠質(zhì)瘤中[13]，且與我們本研究得出的結(jié)論：Fbxw7在低級別膠質(zhì)瘤陽性率升高相吻合，至于具體機(jī)制，還需相關(guān)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。另外，隨著對膠質(zhì)瘤研究的逐步深入，針對特定膠質(zhì)瘤病理類型的研究，為個(gè)體化的單一治療顯的尤為重要，本研究限于標(biāo)本數(shù)量，結(jié)果顯示Fbxw7與少突膠質(zhì)瘤并無相關(guān)性，可能是Fbxw7在少突膠質(zhì)瘤中并無特異性，此方面結(jié)論還需在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上做多中心、多角度的探索。

總之，本研究通過對Fbxw7、IDH1蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況及其之間的關(guān)系，對膠質(zhì)瘤的機(jī)制有了新的認(rèn)識，從診斷角度來說，F(xiàn)bxw7蛋白有望用來反映膠質(zhì)瘤的生物特征，然而Fbxw7蛋白通過何種途徑改變膠質(zhì)瘤的侵襲生長機(jī)制，F(xiàn)bxw7蛋白的不同表達(dá)對膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后影響如何，將是我們下一步工作的重點(diǎn)。