2

(1. 安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心，活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，皖南醫(yī)學(xué)院藥物研發(fā)中心，皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2. 山東大學(xué)蘇州研究院，江蘇 蘇州 215000)

甜葉菊[Stevia rebaudiana (Bertoni).Hemsl]，屬于雙子葉植物綱，菊科多年生草本植物，有生津止渴的功效，用于治療消渴、糖尿病、高血壓等疾病。原產(chǎn)于南美，20世紀(jì)80年代初引進(jìn)國(guó)內(nèi)種植，作為新型糖源植物，其提取得到的糖苷，甜度可達(dá)到糖的300倍左右[1-2]。已有外文文獻(xiàn)報(bào)道甜葉菊根中多糖成分是一種高聚合度的菊糖，且有著優(yōu)良的益生元效應(yīng)[3]。菊糖是一類(lèi)通過(guò)β-(2，1)糖苷鍵連接的天然碳水化合物[4]，具有良好的水溶性和益生元特性，相比其他膳食纖維，菊糖較易溶解，易分散于牛奶、酸奶等飲料中，且不會(huì)吸收大量水分，故比其他膳食纖維更能提高食品飲料的口感和風(fēng)味[5-6]。并且它所含熱量低，人們飲用它不會(huì)導(dǎo)致肥胖，在調(diào)節(jié)機(jī)體平衡、增強(qiáng)胃腸道功能、促進(jìn)機(jī)體代謝等方面有著極其重要的作用，因此廣泛應(yīng)用于食品保健行業(yè)中[7]。雖然微生物和真菌中存在一定的菊糖，但是大多數(shù)的菊糖還是存在于植物體內(nèi)，如菊芋、菊苣、大麗花、婆羅門(mén)參等植物塊莖中，菊糖含量以菊芋為最。但由于菊糖資源的限制，菊糖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到了一定的束縛，故找尋新的、可靠有效的菊糖資源以及菊糖植物迫在眉睫。甜葉菊的葉含有大量糖苷，目前大多中外文獻(xiàn)研究局限于該部位[1-2，8-9]。而甜葉菊的根卻作為廢物被丟棄，并且關(guān)于甜葉菊根多糖的含量以及提取工藝卻未見(jiàn)研究。它的糖苷和提取物具有藥理和治療性質(zhì)，包括抗氧化、抗菌、抗高血壓、抗糖尿病和抗癌，并且市場(chǎng)上目前存在的幾款化學(xué)治療藥大多含有如乳酸酸中毒、金屬味、維生素B12缺乏等不良反應(yīng)[10]，故該糖可能成為潛在的替代產(chǎn)品，具有巨大的開(kāi)發(fā)利用前景。故本文以大量中外文獻(xiàn)為科學(xué)研究依據(jù)，優(yōu)化甜葉菊根多糖的提取工藝以及其抗氧化活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 藥材 新鮮甜葉菊根購(gòu)于安徽宿州，品種為慧昌四號(hào)。

1.2 儀器與試劑 小型高速粉碎機(jī)WK-2000A(青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司) ；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070 型(金壇市榮華儀器制造有限公司)；離心機(jī)SIGMA4K15；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-TeK 公司)；電子天平 FA2004N(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(上海源葉生物科技有限公司)；羥自由基測(cè)試試劑盒(南京建成生物研究所)；總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒：南京建成生物研究所；艾科浦超純水系統(tǒng) AFZ-1001-U(頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 (色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；Sephadex G-50葡聚糖凝膠:Solarbio公司;數(shù)顯控溫水浴鍋 GKC4(上海波洛實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。所用試劑均為分析純，水為去離子水；蒽酮、標(biāo)準(zhǔn)果糖、濃H2SO4、三氯甲烷、正丁醇、無(wú)水乙醇。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理 原料(新鮮甜葉菊根)→洗凈→60℃烘干→粉碎→甜葉菊根干粉(常溫下保存) 。

1.3.2 甜葉菊根多糖的提取 電子天平稱取5 g甜葉菊根干粉，倒入燒杯，加入適量純水，水浴鍋中加熱一定時(shí)間，溶液紗布粗過(guò)濾后，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得。

1.3.3 甜葉菊根多糖提取條件的優(yōu)化 使用相同批次的甜葉菊根干粉作為材料，并使用水作為提取溶劑。并研究了不同固液比，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)甜葉菊根多糖產(chǎn)量的影響。采用正交設(shè)計(jì)方法對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的提取過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，探索影響因素，確定最佳提取條件。

1.4 分析方法

1.4.1 硫酸-蒽酮法測(cè)總糖含量以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用改良蒽酮硫酸法[11]，以果糖為標(biāo)準(zhǔn)品，糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y=3.5856X-0.0044，R2=0.9946。

1.4.2 總糖得率及含量的計(jì)算 根據(jù)供試品吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得出供試品濃度：總糖得率(%)=樣品中總糖含量/原料質(zhì)量×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，以F檢驗(yàn)分析組間顯著性差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 甜葉菊根純多糖抗氧化活性的測(cè)定

1.6.1 對(duì)DPPH自由基的清除率 根據(jù)DPPH自由基有單電子，在517 nm處有一強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用吸光度的變化趨勢(shì)表現(xiàn)抗氧化活性[12]。參照文獻(xiàn)[13]并改進(jìn)，取適量甜葉菊根純糖，用雙蒸水配制成1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml等一系列濃度，稱取適量Vc進(jìn)行上述操作，作為陽(yáng)性對(duì)照。精密稱取4 mg DPPH溶于100 ml無(wú)水乙醇中，制備濃度為80 mmol/L，避光保存在棕色瓶中備用。樣品管中加入0.25 ml不同濃度的多糖或Vc溶液和1.25 ml DPPH溶液;對(duì)照管中用無(wú)水乙醇溶液代替DPPH溶液;空白管中用蒸餾水代替多糖溶液。各管置于28℃水浴鍋中水浴30 min后，吸取200 μl于酶標(biāo)板，在517 nm處測(cè)定吸光度。平行3組，取平均值，按下式計(jì)算多糖對(duì)DPPH自由基的清除率[14]：

清除率(%) =[1- (A樣品-A空白) /A對(duì)照]×100%

1.6.2 清除羥基自由基的能力 Fenton反應(yīng)是最常見(jiàn)的產(chǎn)生羥自由基的化學(xué)反應(yīng)，H2O2的量和Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基的量成正比，當(dāng)給予電子受體后，用Griess試劑顯色，形成紅色物質(zhì)，其呈色與羥基的量成正比關(guān)系。因此可通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定顯色物質(zhì)的吸光度來(lái)反映甜葉菊根多糖清除羥自由基的能力。通過(guò)測(cè)定管吸光度低于對(duì)照管可判斷出甜葉菊根純糖抑制自由基。故底物應(yīng)用液的配制為底物貯備液∶雙蒸水=1∶99。樣品溶液配成與1.6.1相同的系列濃度，Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，雙蒸水調(diào)零，室溫放置20 min后，波長(zhǎng)550 nm，1 cm光徑，測(cè)定吸光度，平行3組，取平均值。按下式計(jì)算甜葉菊根純糖對(duì)羥基自由基的清除率[15]：

羥基自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A空白) /A對(duì)照]×100%

1.6.3 總抗氧化活性 (FRAP) 測(cè)定 采用光脫色熒光恢復(fù)技術(shù)(FRAP)測(cè)定總抗氧化活性。將醋酸緩沖液、TPTZ、FeCl3溶液按照10∶1∶1的比例混合配制成新鮮的FRAP工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，稱取27.8 mg FeSO4-7H2O，用雙蒸水溶解并配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取5 μl標(biāo)準(zhǔn)品溶液，迅速加入180 μl FRAP工作液，以5 μl蒸餾水為空白對(duì)照，37℃孵育5 min，波長(zhǎng)593 nm，酶標(biāo)儀讀取OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取適量甜葉菊根純多糖，用雙蒸水配制成1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml一系列濃度，稱取適量Vc進(jìn)行上述操作，作為陽(yáng)性對(duì)照。分別取5 μl對(duì)照品溶液，迅速加入180 μl FRAP工作液，37℃孵育5 min，在 593 nm下測(cè)定OD值。根據(jù)FeSO4曲線公式計(jì)算FRAP值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 固液比的影響 稱取5 g甜葉菊根粉末，按照固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30提取溫度60℃，提取時(shí)間60 min，按照分析方法1.4提取測(cè)定，計(jì)算多糖提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，隨著固液比的增大，多糖提取率先增加后降低，固液比為1∶20時(shí)達(dá)到最大值，即提取甜葉菊根多糖的效果在固液比為1∶20時(shí)最好，優(yōu)于其他不同固液比的提取條件。

圖1 固液比對(duì)甜葉菊根多糖提取率的影響

2.1.2 提取溫度 稱取5 g甜葉菊根粉末，按照提取溫度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，固液比1∶20，提取時(shí)間60 min，按照分析方法1.4提取測(cè)定，計(jì)算多糖提取率，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，隨著提取溫度的升高，多糖提取率先增加后降低，在溫度高于70℃后，提取率下降了，可能是由于高溫使多糖產(chǎn)生了降解。提取溫度為70℃時(shí)達(dá)到最大值，即提取甜葉菊根多糖的效果在提取溫度為70℃時(shí)最好，優(yōu)于其他不同提取溫度的提取條件。

圖2 提取溫度對(duì)甜葉菊根多糖提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間 稱取5 g甜葉菊根粉末，按照提取時(shí)間30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，固液比1∶20，提取溫度70℃，按照分析方法1.4提取測(cè)定，計(jì)算多糖提取率，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的增加，多糖提取率先增加后降低，提取時(shí)間超過(guò)90 min后，提取率的降低可能是加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的破壞。提取時(shí)間為90 min時(shí)達(dá)到最大值，即提取甜葉菊根多糖的效果在提取時(shí)間為90 min時(shí)最好，優(yōu)于其他不同提取時(shí)間的提取條件。

圖3 提取時(shí)間對(duì)甜葉菊根多糖提取率的影響

2.2 甜葉菊根多糖提取條件的優(yōu)化 通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了甜葉菊根多糖的最佳提取條件，選擇固液比、提取溫度及提取時(shí)間作為研究因素，設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1、表2。由表3可知，因素A具有極顯著性差異(P<0.01)，因素B和C都具有顯著性差異(P<0.05)。因此，影響甜葉菊根多糖提取率的因素依次是：固液比>提取溫度>提取時(shí)間，由表1、2可知最佳提取條件為A3B3C3，即在固液比為1∶30 (g/ml)、提取溫度為80℃、提取時(shí)間為150 min。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由于最優(yōu)組合沒(méi)有在正交實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重現(xiàn)性，將最優(yōu)組合A3B3C3和甜葉菊根多糖提取率最高組合A3B3C2進(jìn)行了對(duì)比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即按所得最優(yōu)組合作三組平行實(shí)驗(yàn)，得到A3B3C3組提取率分別為66.78%、66.23%、67.52%，平均值為66.84%，高于A3B3C2組的65.64%，驗(yàn)證了正交理論組合的可靠性。即甜葉菊根多糖最佳提取工藝條件為固液比為1∶30，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為150 min。

表1 因素與水平設(shè)計(jì)表

表2 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.4 甜葉菊根純糖的洗脫曲線 將1.3.2所得粗糖醇沉24 h，利用sevege試劑進(jìn)行脫蛋白，大孔樹(shù)脂D101脫色，sephadexG50層析純化，測(cè)定各試管吸光度，得到甜葉菊根純糖的洗脫曲線。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 甜葉菊根多糖的洗脫曲線

2.5 甜葉菊根多糖對(duì)DPPH自由基的清除率 以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，甜葉菊根多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，對(duì)比Vc，甜葉菊根多糖對(duì)DPPH自由基有較好的清除能力，隨著質(zhì)量濃度的升高而不斷增強(qiáng)，并在一定的實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。在濃度為5 mg/ml時(shí)，清除率能達(dá)到71.65%。

圖5 甜葉菊根多糖對(duì)DPPH自由基清除率

2.6 甜葉菊根多糖對(duì)羥基自由基的清除率 以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定甜葉菊根多糖對(duì)羥基自由基 (羥OH) 的清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，對(duì)比Vc，甜葉菊根多糖對(duì)羥自由基的清除非常明顯，隨著質(zhì)量濃度的升高，清除率接近Vc。在濃度為5 mg/ml時(shí)，清除率可達(dá)到90.51%。

2.7 甜葉菊根多糖的總抗氧化能力的測(cè)定(FRAP)

2.7.1 FeSO4-7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖7可得到FeSO4-7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=1.4018X+0.0615，X表示FeSO4濃度，Y表示吸光度。R2=0.9927，證明在0.16～0.56 mmol/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.2 甜葉菊根多糖FRAP值的測(cè)定 以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定甜葉菊根多糖的FRAP值，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，甜葉菊根多糖的總抗氧化活性良好，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，隨著質(zhì)量濃度的增加，F(xiàn)RAP值也隨之升高。

圖6 甜葉菊根多糖對(duì)羥基自由基清除作用

圖7 FeSO4-7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 甜葉菊根多糖的FRAP值

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)分析后，選取固液比、提取溫度、提取時(shí)間為研究因素，進(jìn)行L9(33) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合方差分析得到影響因素為：固液比>提取溫度>提取時(shí)間，最佳提取條件為，固液比1∶30、提取溫度80℃、提取時(shí)間150 min。后續(xù)用SephadexG-50柱層析純化也呈現(xiàn)出較好對(duì)稱性，說(shuō)明該多糖是較高純度的單一組分多糖，并且可看出純化后的多糖純度較高，含雜質(zhì)較少。同時(shí)，甜葉菊根多糖也具有良好的抗氧化活性，雖然低于陽(yáng)性對(duì)照Vc，但在濃度為5 mg/ml時(shí)，對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別達(dá)到73.30%和90.51%。在甜葉菊根純糖濃度為6 mg/ml時(shí)，F(xiàn)RAP值達(dá)到了(33.172±0.184) mmol/ml，呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。該糖目前在已知文獻(xiàn)中研究極少，但其表現(xiàn)出的活性值得研究，存在較高的研究?jī)r(jià)值。