張怡塵 曹 曦 楊金奎

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科 糖尿病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市糖尿病研究所，北京 100730)

糖尿病作為醫(yī)療緊急事件之一，已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的巨大挑戰(zhàn)。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會的報告，成人糖尿病的總患病率為9.1%，而中國是全球糖尿病患病人數(shù)最多的國家[1]。糖尿病是一種因胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗導(dǎo)致的疾病。肝臟作為胰島素作用的重要靶器官之一，對維持機(jī)體的糖脂代謝平衡起重要作用，而肝臟胰島素抵抗(insulin resistance，IR)主要表現(xiàn)為肝糖生成增多、脂代謝紊亂和肝臟脂肪沉積，在2型糖尿病和非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。

腎素-血管緊張素系統(tǒng) (rennin angiotensin system， RAS) 是控制血壓和水電解質(zhì)平衡的關(guān)鍵因素，也是機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)[3]。近年來研究[4]表明RAS在糖尿病以及代謝紊亂綜合征的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的調(diào)節(jié)作用，而新發(fā)現(xiàn)的ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸，可以拮抗經(jīng)典軸ACE-AngⅡ-AT1的生物效應(yīng)，從而發(fā)揮其保護(hù)作用。MAS蛋白由325個氨基酸組成，屬于G蛋白超偶聯(lián)受體亞家族。2003年Santos等[5]的研究證明G蛋白偶聯(lián)受體MAS是Ang-(1-7)的功能性結(jié)合位點(diǎn)，MAS受體在人和小鼠的腦、腎、睪丸、心臟和血管等組織中均有表達(dá)[6-9]?，F(xiàn)有研究[3]證明，MAS受體在許多疾病模型的治療中發(fā)揮了積極作用，例如心血管疾病、代謝相關(guān)疾病、腎病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

本課題組的前期研究[10-11]表明，ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸可以抑制肝臟胰島素抵抗及肝臟脂肪變性，但MAS受體在肝臟糖脂代謝過程中的具體作用機(jī)制還鮮有報道。本文將在細(xì)胞水平初步探索MAS對肝臟糖脂代謝的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病毒構(gòu)建

將小鼠MAS基因(975 bp)重組到腺病毒載體質(zhì)粒PDC316-mCMV-ZsGreen上，用攜帶目的基因的重組質(zhì)粒PDC316-mCMV-ZsGreen-MAS和PDC316-mCMV-ZsGreen以及骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得攜帶目的基因的腺病毒，通過擴(kuò)增最終得到1×1010pfu/mL滴度的綠色熒光蛋白-腺病毒(adenovirus of a green florescent protein，Ad-GFP)和1.5×1010pfu/mL滴度的鼠MAS-綠色熒光蛋白-腺病毒(adenovirus coding for mouse MAS upstream of a green florescent protein，Ad-mMAS-GFP)(Sino-GenoMax公司， 中國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系HepG2購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞資源中心，用MEM(Gibco 公司，美國)進(jìn)行培養(yǎng)，加入10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(Gibco公司，美國)、100 U/mL 青霉素和0.1 g/L鏈霉素(Solarbio公司，中國)，置于37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2孵箱中培養(yǎng)，每2天用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶(Solarbio公司，中國)消化傳代。調(diào)整細(xì)胞密度為 2×105個細(xì)胞/mL，分別接種于6孔板、12孔板。對照組以1.0×108pfu/mL滴度的Ad-GFP 病毒，實(shí)驗(yàn)組以1.5×108pfu/mL滴度的Ad-mMAS-GFP，病毒孵育HepG2細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡觀察病毒感染效率。

1.3 毒胡蘿卜素(thapsigargin,Tg)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型的構(gòu)建

以不同濃度(0、2、5、8 μmol/L)的毒胡蘿卜素(Sigma公司，美國)處理HepG2細(xì)胞24 h，以0 μmol/L作為對照；設(shè)0、8、12、24 h 4個刺激時間，以刺激0 h為對照。根據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)mRNA表達(dá)水平選取Tg最佳處理濃度和時間，構(gòu)建HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型。

1.4 酶法檢測細(xì)胞內(nèi)三酰甘油及總膽固醇含量

采用組織三酰甘油酶法測定(組織、細(xì)胞)試劑盒 (普利萊公司， 中國) 測定細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量， 以每毫克蛋白濃度校正三酰甘油含量。采用組織總膽固醇含量測定(組織、細(xì)胞)試劑盒(中國普利萊公司)測定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量，以每毫克蛋白濃度校正膽固醇含量。

1.5 細(xì)胞糖原含量測定

將各組細(xì)胞用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3遍，置于-20 ℃冰箱中冰凍后取出，每瓶細(xì)胞使用強(qiáng)堿性提取液裂解，其中一部分用于蛋白定量，一部分用于糖原測定。采用蒽酮法測定糖原的含量，利用強(qiáng)堿性提取液提取糖原，在強(qiáng)酸性條件下利用蒽酮顯色劑測定糖原含量，試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.6 RNA的提取和實(shí)時定量熒光PCR

采用培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒(Tiangen公司，中國)提取RNA，以RNA為模板利用Fastking一步法RT-PCR試劑盒(天根公司，中國)合成cDNA。采用 Light Cycler 96儀器(Roche公司，美國)檢測RNA的表達(dá)情況， 經(jīng)分析系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)表達(dá)的定量。引物序列詳見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.7 Western blotting檢測

收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的含有蛋白酶抑制劑混合物(thermo Scientific公司，美國)和磷酸酶抑制劑混合物(thermo Scientific公司，美國)的RIPA緩沖液中裂解提取HepG2細(xì)胞蛋白。用BCA蛋白分析試劑盒(碧云天公司)測定樣品蛋白濃度。每個樣本取60 μg總蛋白進(jìn)行10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的SDS-PAGE電泳，并濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride， PVDF)上，用含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的TBST[TBS+0.1%(體積分?jǐn)?shù))Tween-20]溶液封閉1.5 h，按照1∶1 000用封閉液將一抗稀釋，將孵育了一抗的膜4 ℃搖床過夜。次日TBST漂洗3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP)標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，以肌動蛋白(β-actin) 作為內(nèi)參，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence， ECL)法和Chemi-Doc Touch凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)顯影成像，并用Image Lab軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。分別計算出葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase， G6pase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase， PEPCK)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、乙酰輔酶A羧化酶α(acetyl CoA carboxylase α， ACCα)、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶α(phosphorylated acetyl CoA carboxylase α， p-ACCα)與內(nèi)參β-actin的吸光度積分值之比分別作為其相對含量值?？笹RP78、CHOP、PEPCK、FAS、β-actin抗體均購自美國Cell signaling technology公司，抗MAS、G6Pase抗體購自美國Abcam公司，抗ACCα、P-ACCα抗體購自美國Santa公司。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Tg誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且上調(diào)MAS的表達(dá)

用不同濃度的Tg和不同的刺激時間處理HepG2細(xì)胞，Real-time PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因和MAS的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Tg可顯著上調(diào) GRP78和CHOP的表達(dá)，同時MAS的表達(dá)也顯著增加，在Tg為5 μmol/L，處理12 h，GRP78、CHOP和MAS的表達(dá)量達(dá)到最大值，且與對照組比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，P<0.001，P<0.000 1，圖1A， B)。提示5 μmol/L Tg孵育12 h后，可成功構(gòu)建HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，因而選擇此條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時，MAS的mRNA表達(dá)上調(diào)，提示MAS可能參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)作用。

2.2 MAS腺病毒感染HepG2細(xì)胞

經(jīng)質(zhì)粒NheⅠ+HindⅢ雙酶切鑒定(圖2A)，陽性克隆可切出975 bp的條帶，將重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增測序，所得結(jié)果與合成序列比對后結(jié)果無誤，說明MAS定向插入真核表達(dá)載體中。以Ad-mMAS-GFP和Ad-GFP分別感染HepG2細(xì)胞，24 h后熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度(圖2B)。采用Real-time PCR及Western blotting分別檢測MAS在HepG2細(xì)胞中mRNA及蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，Ad-mMAS-GFP組MAS的mRNA及蛋白水平與對照組相比明顯上調(diào)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，圖2C、D)。

2.3 過表達(dá)MAS改善Tg誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡

為進(jìn)一步研究MAS對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的保護(hù)作用，將HepG2細(xì)胞在感染Ad-mMAS-GFP和Ad-GFP后以5 μmol/L Tg處理12 h，以空白細(xì)胞為對照。結(jié)果顯示，Ad-mMAS-GFP組與Ad-GFP組相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路相關(guān)基因如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)、X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)和肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme-1, IRE1);生長抑制DNA損傷基因34(growth arrest and DNA damage inducible 34， GADD34)和蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein-kinase-like ER kinase，PERK)的mRNA有下調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A)；同時促凋亡基因Bax、Caspase-12的mRNA均顯著降低，而抗凋亡基因Bcl-2的mRNA無明顯變化(圖3B)。提示MAS對Tg誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡有保護(hù)作用，并且MAS可能是通過改善細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平從而減少了HepG2細(xì)胞的凋亡。

2.4 過表達(dá)MAS改善了Tg誘導(dǎo)的 HepG2細(xì)胞的糖脂代謝

為了觀察過表達(dá)MAS對肝內(nèi)糖脂代謝的影響，檢測了HepG2細(xì)胞內(nèi)三酰甘油、總膽固醇及糖原含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Ad-GFP組相比，感染Ad-mMAS-GFP組的三酰甘油含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖4A)，而細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量無明顯變化(圖4B)。同時，MAS過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)糖原含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖4C)。MAS可能通過改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而減少HepG2細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的積累，并且升高細(xì)胞內(nèi)糖原含量。

圖1 毒胡蘿卜素處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞中GRP78、CHOP、MAS基因的表達(dá)Fig.1 Expression of GRP78， CHOP and MAS genes in cells after treatment with HepG2 cells by thapsigargin

A：relative GRP78,CHOP,MAS mRNA levels following treatment with 0， 2， 5， 8 μmol/L thapsigargin for 0,8,12,24 h;B:relative GRP78、CHOP、MAS mRNA levels following treatment with 5 μmol/L thapsigargin for 0， 8， 12， 24 h.GRP78: glucose regulated protein 78;CHOP: C/EBP-homologous protein;Tg:thapsigargin;**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1vscontrol group，n=4.

圖2 MAS過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞Fig.2 HepG2 cells transfected by MAS overexpressing adenovirus

A：double enzyme digestion identification;1：control;2：PDC316-mCMV-ZsGreen-MASKpnI-EcoRIdouble enzyme digestion identification results;M: Trans2K plus marker；B: HepG2 cells transfected by MAS over-expression plasmid (upper) and Ad-GFP vector (lower);Bar: 100 μm;C： expression of MAS protein in HepG2 cells;*P<0.05vsAd-GFP group，n=3；D: expression levels of MAS gene in HepG2 cells;**P<0.01vsAd-GFP vector group，n=4;Ad-GFP:adenovirus green fluorescent protein;Ad-mMAS-GFP:adenovirus coding for mouse MAS upstream of a green florescent protein.

圖3 MAS對HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響Fig.3 Effect of MAS on endoplasmic reticulum stress and apoptosis-related genes in HepG2 cells

A:effect of MAS on endoplasmic reticulum stress genes expression in HepG2 cells;B:effect of MAS on apoptosis genes expression in HepG2 cells;*P<0.05，**P<0.01vsAd-GFP+Tg vector group，n=4;Ad-GFP: adenovirus green fluorescent protein;Ad-mMAS-GFP:adenovirus coding for mouse MAS upstream of a green florescent protein;GRP78: glucose regulated protein 78;CHOP: C/EBP-homologous protein;ATF6: activating transcription factor 6;Xbp1: X box-binding protein 1;IRE1: inositol requiring protein 1;GADD34: growth arrest and DNA damage inducible 34;PERK: protein-kinase-like endoplasmic reticulum kinase;Tg:thapsigargin;Bcl-2: B cell lymphoma/lewkmia-2;Caspase-3: cysteine aspartyl protease-3;Caspase-12: cysteine aspartyl protease-12.

2.5 MAS對糖脂代謝相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究過表達(dá)MAS對HepG2細(xì)胞的糖脂代謝的影響，在分子水平分別檢測對照組與實(shí)驗(yàn)組糖脂代謝相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，過表達(dá)MAS之后，糖異生關(guān)鍵酶G6pase、PEPCK和脂質(zhì)合成相關(guān)的FAS、ACCα在蛋白水平表達(dá)均下調(diào)。同樣，在mRNA水平，過表達(dá)MAS組的糖脂代謝相關(guān)基因G6pase、PEPCK、FAS、ACCα、肝X受體α(liver X receptor alpha,XLXRα)的表達(dá)下調(diào)，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。而脂代謝相關(guān)的膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element-binding protein 1c， SREBP1c)的表達(dá)雖有下調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucose transport 2, Glut 2)及脂肪酸β氧化關(guān)鍵酶肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(carnitine palmitoyl transferase 1 α， CPT1α) 在mRNA水平表達(dá)無明顯變化。以上結(jié)果表明，MAS可以通過改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞內(nèi)糖脂代謝(P<0.05，P<0.01，圖5)。

圖4 MAS對HepG2細(xì)胞內(nèi)的三酰甘油、總膽固醇和糖原含量的影響Fig.4 Effect of MAS on triglyceride， total cholesterol and glycogen content in HepG2 Cells

A:triglyceride content;B: total cholesterol content;C: glycogen content;**P<0.01vsAd-GFP+Tg vector group，n=3;Ad-GFP: adenovirus green fluorescent protein;Ad-mMAS-GFP:adenovirus coding for mouse MAS upstream of a green florescent protein;Tg:thapsigargin.

圖5 MAS對HepG2細(xì)胞糖脂代謝相關(guān)分子表達(dá)的影響Fig.5 Effect of MAS on the expression of molecules related to glycolipid metabolism in HepG2 cells

A：relative protein expression levels of p-ACCα， ACCα， FAS， G6pase， PEPCK in HepG2 cells following overexpression of MAS;B： relative mRNA expression levels of G6pase， PEPCK， Glut2 in HepG2 cells following overexpression of MAS;C: relative mRNA expression levels of FAS， ACCα， LXRα， SREBP1c，CPT1α in HepG2 cells following overexpression of MAS;*P<0.05，**P<0.01，n=4;Ad-GFP: adenovirus green fluorescent protein;Ad-mMAS-GFP:adenovirus coding for mouse MAS upstream of a green florescent protein;G6pase: glucose-6-phosphatase;PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase;FAS:fatty acid synthase;p-ACCα: phosphorylated-acetyl CoA carboxylase α;Glut2:glucose transporter 2;LXRα: liver X receptor alpha;CPT1α: carnitine palmitoyl transferase 1 α;SREBP1c: sterol-regulatory element-binding protein 1c;Tg:thapsigargin.

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛存在于真核細(xì)胞中，它不僅為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、翻譯后的修飾以及折疊提供特定的環(huán)境，還是鈣離子儲存的主要場所，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣平衡和鈣介導(dǎo)的信號通路，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還與膽固醇和磷脂等的代謝直接相關(guān)[12]。最近的研究[13]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與糖尿病、高血壓、心肌肥厚、動脈粥樣硬化和缺血性心臟病。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑通過不同機(jī)制誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，其中，毒胡蘿卜素應(yīng)用較廣泛。Tg是肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase， SERCA)的抑制劑，可抑制鈣離子由細(xì)胞質(zhì)泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而參與鈣離子平衡的調(diào)節(jié)和凋亡的發(fā)生[14]。多項(xiàng)研究[15-18]顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡與肝臟損傷以及糖脂代謝異常相關(guān)。而2012年，Arumugam等[19]的研究表明坎地沙坦可能是通過激活A(yù)CE2-Ang-(1-7)-MAS軸來調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和其介導(dǎo)的心臟細(xì)胞凋亡來阻止擴(kuò)張型心肌病的進(jìn)展；2013年，Uhal等[20]報道Ang-(1-7)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的凋亡，提示ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間存在相關(guān)性。以上研究結(jié)果提示，在肝臟中ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間也可能存在相關(guān)性。

胰島素抵抗是指胰島素的靶器官包括肝臟、脂肪組織、胰島素β細(xì)胞等對胰島素的敏感性及反應(yīng)性降低。胰島素抵抗是導(dǎo)致肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝性疾病的核心病理變化。RAS中的血管緊張素Ⅱ在IR過程中發(fā)揮重要作用，而Ang-(1-7)則發(fā)揮與血管緊張素Ⅱ相反的作用[21-22]?，F(xiàn)有研究[23]表明，過表達(dá)ACE2可以保護(hù)胰腺β細(xì)胞免受氧化損傷；Ang-(1-7)改善非酒精性脂肪變性和炎性反應(yīng)以及肝纖維化和肝臟對胰島素的敏感性[24]；Ang-(1-7)還能抑制氧化應(yīng)激并通過脂肪細(xì)胞中的MAS受體改善葡萄糖攝取[25]。以上這些研究主要是集中在ACE2和Ang-(1-7)上，而Santos等[26]的研究表明，MAS基因缺失的小鼠表現(xiàn)出血脂異常，葡萄糖耐受不良和胰島素敏感性降低以及脂肪細(xì)胞對胰島素刺激的葡萄糖攝取的減少和脂肪組織中Glut 4的減少。另一項(xiàng)研究[27]表明，MAS受體的遺傳缺失導(dǎo)致腎小球高濾過和微量白蛋白尿。以上這些研究說明，MAS受體作為關(guān)鍵因子，在ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸中發(fā)揮著重要作用。本研究表明，在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)MAS受體，改善了Tg誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時還改善了Tg誘導(dǎo)后HepG2細(xì)胞的糖脂代謝，這可能與MAS對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)作用有關(guān)。

在本研究中，以MAS過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，之后用毒胡蘿卜素處理以構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，在此基礎(chǔ)上，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP78、CHOP和凋亡相關(guān)基因PERK、IRE1、ATF6、Caspase-3以及Caspase-12表達(dá)均顯著降低，同時HepG2細(xì)胞三酰甘油含量降低，糖原含量升高。而糖異生關(guān)鍵酶G6pase和PEPCK、脂質(zhì)合成相關(guān)的FAS和ACCα在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)均下調(diào)。這說明，MAS可能是通過對HepG2細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)作用從而改善HepG2細(xì)胞的糖脂代謝。

本研究探討了MAS受體與HepG2細(xì)胞糖脂代謝之間的關(guān)系，但還存在不足之處：①目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅在細(xì)胞水平，下一步計劃在MAS敲除小鼠及高脂誘導(dǎo)模型鼠上進(jìn)一步觀察ACE2-Ang(1-7)-Mas軸對肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及糖脂代謝的影響；②目前，MAS對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響的具體機(jī)制還不清楚，之后將在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)方面進(jìn)行進(jìn)一步研究；③肝臟只是胰島素作用的靶器官之一，下一步將繼續(xù)研究MAS受體在肌肉、脂肪等代謝相關(guān)組織器官中發(fā)揮的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，MAS受體表達(dá)上調(diào)可以改善HepG2細(xì)胞內(nèi)糖脂代謝，這一過程可能是通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平和減少肝細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果進(jìn)一步明確了MAS在肝細(xì)胞糖脂代謝中的調(diào)節(jié)作用，并為ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸在改善胰島素抵抗機(jī)制中的作用提供了新的思路。