尹彩霞 陳 晶 張 玨

遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校，貴州 遵義 563003

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)又名阿爾采末病，是老年性癡呆最常見的類型，主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)性記憶丟失和漸進(jìn)性認(rèn)知功能障礙[1]。其神經(jīng)病理學(xué)特征主要包括海馬和皮質(zhì)部位神經(jīng)元的缺失、細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積形成的Aβ斑(老年斑)、細(xì)胞內(nèi)tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[1-2]。其中，Aβ沉積是導(dǎo)致海馬神經(jīng)元病變、引發(fā)AD最主要的原因[3]，而且研究已經(jīng)證實(shí)過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome-Proliferator-Activated receptors，PPARs)可參與調(diào)節(jié)這一過程[4]。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)化學(xué)名為2-脫氧-2-{(甲基-亞硝基氨基)羰基-氨基}-D-吡喃葡萄糖，是一種具有毒性的氨基葡萄糖-亞硝基脲化合物，可選擇性地摧毀胰島β細(xì)胞，使得胰島素信號(hào)途徑受阻[5-6]。除此之外，側(cè)腦室內(nèi)注射STZ可引發(fā)皮質(zhì)與海馬的葡萄糖代謝減慢，導(dǎo)致突觸丟失、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，促進(jìn)Aβ的異常增加，最終誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶功能障礙[7]。目前，應(yīng)用STZ誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷建立AD動(dòng)物模型已被廣泛用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[8-10]。迄今為止，臨床用于抗AD的藥物(如膽堿酯酶抑制劑加蘭他敏、NMDA受體拮抗劑美金剛)只能延緩AD的病程及發(fā)生，又因其毒副作用大，使得療效受限。因此，基于AD的發(fā)病機(jī)制探索新型AD治療藥物迫在眉睫。

寶藿苷Ⅰ(Baohuoside I)又稱淫羊藿次苷II，是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥淫羊藿(HerbaEpimedii)的基本藥用活性成分之一，屬于天然黃酮醇苷類化合物，具有抗炎、減輕缺血性腦損傷、抗腫瘤、改善性功能障礙等多種藥理學(xué)作用，其分子量為514.53，結(jié)構(gòu)式如圖1所示[11-14]。而且，新近研究發(fā)現(xiàn)Baohuoside I減輕缺血性腦損傷的機(jī)制與PPARα、PPARγ的上調(diào)有關(guān)[13]。值得注意的是，已有研究證實(shí)Baohuoside I 可通過增加PPARγ的蛋白表達(dá)，從而抑制BACE1的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Aβ代謝，最終減輕APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶下降及海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，起到抗AD的作用[15]。此外，本課題組研究發(fā)現(xiàn)Baohuoside I能改善側(cè)腦室內(nèi)注射STZ所致的AD大鼠認(rèn)知功能減退及海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，其機(jī)制與阻遏Aβ的異常增加有關(guān)[8]，同時(shí)綜合上述的前期研究我們推測(cè)PPARα、PPARγ參與了這一過程。因此，本研究繼續(xù)采用STZ誘導(dǎo)的類AD樣大鼠模型，探索Baohuoside I減輕該模型大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷的機(jī)制是否與PPARα、PPARγ有關(guān)，為Baohuoside I用于AD的防治提供新的藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究所用的40只成年雄性SD大鼠購(gòu)買于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均為SPF級(jí)，體重260 g～270 g，許可證號(hào)為SCXK-(軍)2012-0011。大鼠以每籠5只適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要藥品、試劑、儀器設(shè)備 鏈脲佐菌素(貨號(hào)S0130)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；寶藿苷I(純度≥98%，批號(hào)140701)購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥有限公司；甲苯胺藍(lán)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；PPARα兔多克隆抗體及PPARγ兔多克隆抗體均購(gòu)于英國(guó)Abcam有限公司；β-actin小鼠單克隆抗體購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；SR-6N大鼠腦立體定位儀購(gòu)自日本東京Setagaya.ku 公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀及Quantity One-全自動(dòng)凝膠成像分析儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；BX43正置顯微鏡購(gòu)于日本Olympus 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥方法 將40只成年雄性SD大鼠隨機(jī)均分為4組：假手術(shù)組、STZ組、Baohuoside I低劑量組、Baohuoside I高劑量組。用7%水合氯醛將大鼠麻醉(0.5 mL /100 g，i.p)，然后再將其頭部固定于大鼠腦立體定位裝置上，沿頭皮中間位置切一矢狀切口，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》確定大鼠側(cè)腦室進(jìn)針坐標(biāo)(前囟后0.8 mm，中線旁開1.5 mm，顱骨下3.6 mm)進(jìn)行模型的制備。STZ組和Baohuoside I低、高劑量組大鼠經(jīng)微量注射器在第1天和第3天分別向雙側(cè)側(cè)腦室勻速推注STZ(濃度為1.5 mg/kg，用0.05 mmol/L 檸檬酸緩沖液配置，并調(diào)節(jié)pH 值為 4.2，需現(xiàn)配現(xiàn)用，冰上操作)5 μL，同法向假手術(shù)組大鼠雙側(cè)側(cè)腦室推注等體積溶媒(檸檬酸緩沖液)。第3天手術(shù)結(jié)束后次日開始給藥，Baohuoside I經(jīng)雙蒸水溶解，低劑量組每日灌胃Baohuoside I 3 mg/kg，高劑量組每日灌胃Baohuoside I 10 mg/kg，連續(xù)給藥21 d，假手術(shù)組和STZ組同法灌胃等體積雙蒸水，同時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠體重的變化。實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)如圖2所示。

1.2.2 HE染色、Nissl染色 大鼠經(jīng)Baohuoside I給藥結(jié)束后，各組隨機(jī)抽取3只，用4%多聚甲醛進(jìn)行透灌，透灌結(jié)束后立即斷頭取腦，取下的全腦用4%多聚甲醛溶液固定5 d，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，最后將蠟塊切片(厚度為5 μm)，置于60 ℃烘箱中粘片，分別進(jìn)行HE染色(主要用蘇木素、伊紅染色)和Nissl染色(主要用甲苯胺藍(lán)染色)，BX43正置顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷情況及海馬神經(jīng)元的存活情況。

1.2.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) Baohuoside I給藥結(jié)束后，處死大鼠，冰上分離雙側(cè)海馬，置于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩７Q取海馬組織50 mg，用RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白濃度用BCA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。制備含20μg蛋白的上樣樣本，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，用電轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉120 min，加入一抗(PPARα，1∶1000；PPARγ，1∶1 000；β-actin，1∶5000)于 4℃孵育過夜，再加入二抗(1∶2000)于常溫孵育60 min。二抗反應(yīng)結(jié)束后，相應(yīng)的條帶用ECL發(fā)光劑顯影，并置于全自動(dòng)凝膠成像分析儀中測(cè)定泳帶的吸光度積分值。

2 結(jié)果

2.1 Baohuoside I對(duì)STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷的影響 HE染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷情況。如圖3所示，假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整，無明顯損傷；STZ組大鼠海馬神經(jīng)元萎縮，核出現(xiàn)深染甚至消失，損傷嚴(yán)重；Baohuoside I高劑量治療后，大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較為清晰完整，損傷明顯減輕。

2.2 Baohuoside I對(duì)STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬存活神經(jīng)元數(shù)目減少的影響 尼氏染色觀察大鼠海馬存活神經(jīng)元情況。如表1及圖4所示，假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰完整；STZ組大鼠海馬神經(jīng)元萎縮，存活神經(jīng)元數(shù)量顯著減少；Baohuoside I高劑量治療后，大鼠海馬神經(jīng)元少有萎縮，存活神經(jīng)元數(shù)量明顯增加。

表1 Baohuoside I對(duì)STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬存活神經(jīng)元數(shù)目減少的影響

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與STZ組比較，##P<0.01。

2.3 Baohuoside I對(duì)大鼠海馬PPARα蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)大鼠海馬PPARα蛋白表達(dá)。如表2及圖5所示，與假手術(shù)組比較，STZ組PPARα 蛋白表達(dá)增加；Baohuoside I高劑量連續(xù)給藥21 d后，顯著增加了STZ 大鼠海馬PPARα的蛋白表達(dá)。

表2 Baohuoside I對(duì)大鼠海馬PPARα蛋白表達(dá)的影響

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與STZ組比較，#P<0.05。

2.4 Baohuoside I對(duì)大鼠海馬PPARγ蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)大鼠海馬PPARγ蛋白表達(dá)。如表3及圖6所示，與假手術(shù)組比較，STZ組PPARγ 蛋白表達(dá)增加；Baohuoside I高劑量連續(xù)給藥21 d后，顯著增加了STZ 大鼠海馬PPARγ的蛋白表達(dá)。

表3 Baohuoside I對(duì)大鼠海馬PPARγ蛋白表達(dá)的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與STZ組比較，##P<0.01。

3 討論

AD是一種由多因素導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其初始階段主要表現(xiàn)為腦內(nèi)胰島素抵抗引起的胰島素信號(hào)障礙和葡萄糖攝入不足引起的葡萄糖代謝減慢[1, 16]。STZ作為一個(gè)有毒的烷基化氨基葡萄糖-亞硝基脲化合物，可激活聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[poly (ADP-ribose) polymerase，PARP]，使DNA發(fā)生烷基化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞壞死[6]。近年來，大量研究表明雙側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射STZ可引起胰島素受體功能障礙、葡萄糖代謝率降低，最終表現(xiàn)出Aβ異常增加、tau蛋白異常磷酸化、海馬神經(jīng)元受損缺失、突觸丟失等類似于AD的病理學(xué)特征[7, 17]。因此，本研究采用STZ雙側(cè)側(cè)腦室注射誘導(dǎo)類AD樣大鼠模型，探索Baohuoside I能否減輕該模型大鼠的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷及初探其可能的機(jī)制。眾所周知，海馬和皮質(zhì)部位的膽堿能神經(jīng)元缺失變性是AD的特征性病理學(xué)變化之一[18]。本研究采用HE染色觀察大鼠海馬CA2區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)，結(jié)果顯示STZ組大鼠海馬神經(jīng)元變性且核固縮，結(jié)構(gòu)明顯受損，與Rostami等的研究一致[17]，提示大鼠經(jīng)雙側(cè)側(cè)腦室注射STZ后可引起海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷。與此同時(shí)，大鼠經(jīng)Baohuoside I 10 mg/kg治療后神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷得到明顯緩解。由此可見，Baohuoside I 10 mg/kg可阻遏STZ組大鼠的海馬神經(jīng)元受損缺失。值得注意的是，Baohuoside I 3 mg/kg連續(xù)給藥不能減輕STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷，提示Baohuoside I在本實(shí)驗(yàn)條件下的閾劑量大于3 mg/kg。神經(jīng)元的功能狀態(tài)主要由尼氏小體反映，尼氏小體數(shù)量多且體積大，說明神經(jīng)元合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng)。然而，一旦神經(jīng)元受到損傷，尼氏小體就會(huì)溶解甚至消失。因此，本研究采用尼氏染色法對(duì)海馬神經(jīng)元存活情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明STZ組大鼠尼氏小體的數(shù)目明顯減少，與前期研究一致[8]。長(zhǎng)期給予Baohuoside I 10 mg/kg治療后大鼠尼氏小體的數(shù)量顯著增多。由此可見，Baohuoside I 10 mg/kg可阻遏STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬存活神經(jīng)元數(shù)目的減少，進(jìn)而維持海馬存活神經(jīng)元的數(shù)量。

實(shí)際上，本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)，Baohuoside I可通過減少淀粉樣前體蛋白APP(amyloid precursor protein，APP)、β-分泌酶(β-site APP cleavage enzyme，BACE1)的蛋白表達(dá)抑制Aβ的生成，同時(shí)還能增加腦啡肽酶(neprilysin，NEP)的蛋白表達(dá)促進(jìn)Aβ的代謝，最終減少Aβ的異常增加，改善STZ誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，起到抗AD的作用。而且，越來越多的研究表明在AD動(dòng)物模型腦內(nèi)Aβ的減少與PPARα、PPARγ密切相關(guān)[4]。PPARα、PPARγ均屬于核轉(zhuǎn)錄因子，在激活狀態(tài)下，能與視黃素x受體形成異質(zhì)二聚體，形成的異質(zhì)二聚體可與過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)[4-19]。其中，PPARα激活后可上調(diào)α-分泌酶(a disintegrin and metalloproteinase domain 10， ADAM10)的基因表達(dá)，使APP降解，從而減少Aβ的生成。而PPARγ激活后能抑制BACE1的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控APP的進(jìn)程，從而影響Aβ的生成。此外，PPARγ對(duì)Aβ的清除具有促進(jìn)作用[4]。由此可見，PPARα和PPARγ在Aβ的生成、代謝過程中均起著至關(guān)重要的作用。綜上所述，筆者推測(cè)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的Baohuoside I減少STZ大鼠腦內(nèi)Aβ異常增加的機(jī)制與PPARα和PPARγ的激活有關(guān)。因此，本研究采用Western blot法檢測(cè)大鼠海馬PPARα和PPARγ的蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)STZ組大鼠海馬PPARα和PPARγ的蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組，同時(shí)Baohuoside I 10 mg/kg給藥組PPARα和PPARγ的蛋白表達(dá)明顯高于STZ組，與Li等的研究結(jié)果類似[20]。此結(jié)果提示，Baohuoside I 10 mg/kg可通過激活PPARα和PPARγ，減少STZ誘導(dǎo)的Aβ異常增加。然而，為什么STZ組PPARα和PPARγ的蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組，可能與STZ制模時(shí)的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)，這是本課題組后續(xù)研究的重點(diǎn)。

總之，本研究證實(shí)了PPARα和PPARγ參與了側(cè)腦室內(nèi)注射STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷的調(diào)控過程，加深了課題組對(duì)AD腦內(nèi)Aβ異常增加機(jī)制的認(rèn)識(shí)。Baohuoside I可減輕STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬CA2區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的損傷，其機(jī)制與PPARα和PPARγ的激活有關(guān)。