張琪 董海常 劉建濤 卜培龍 李全營 秦長江

大腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，總體生存率較低［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國大腸癌的發(fā)病率占所有惡性腫瘤的第4位，死亡率居第5位［2］，嚴(yán)重威脅著人類的健康。由于大腸癌起病隱匿，通常就診時(shí)已發(fā)展為進(jìn)展期或晚期大腸癌。近年來，隨著對(duì)大腸癌的認(rèn)識(shí)及診治水平的不斷提高，大腸癌的發(fā)病率和死亡率較前有所減低，但最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明大腸癌的新發(fā)病例及死亡率在全球仍居第3位［3-4］。

驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員20A（kinesin family member 20A，KIF20A）位于人5q31.2染色體上，主要通過與微管結(jié)合，水解ATP產(chǎn)生機(jī)械能，干擾細(xì)胞有絲分裂過程［5］，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。多項(xiàng)研究表明，KIF20A 在人類多種惡性腫瘤如惡性黑色素瘤［6］、乳腺癌［7-8］、鼻咽癌［9］、胰腺癌［10-12］、肝細(xì)胞癌［13］及肺癌［14-15］等異常表達(dá)，且與腫瘤的增殖、侵襲及預(yù)后密切相關(guān)。目前尚缺乏KIF20A在大腸癌中的研究報(bào)道。

本研究首先通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中KIF20A在大腸癌組織中的mRNA表達(dá)，然后采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)一步檢測(cè)KIF20A在大腸癌組織中的蛋白表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的相關(guān)性，探討其在大腸癌臨床診治過程中的價(jià)值，以期作為新的生物標(biāo)志物，為大腸癌的早期診斷及預(yù)后評(píng)估提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年1月至2012年12月在河南大學(xué)淮河醫(yī)院105 例經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢測(cè)確診為大腸癌的石蠟組織樣本。所有樣本均采用美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）確定組織學(xué)腫瘤分級(jí)和分期。其中男性65例，女性40 例；年齡≤60 歲46 例，＞60 歲59 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）術(shù)前未進(jìn)行新輔助治療，包括放療、化療、放化療；2）原發(fā)腫瘤為大腸癌，無合并其他惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤；3）臨床病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌或者合并有其他臟器的原發(fā)惡性腫瘤史；2）有肺部、肝臟等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。

1.2 方法

1.2.1 生物學(xué)分析 本研究從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//genomecancer.ucsc.edu）下載所有可用的大腸癌mRNA 數(shù)據(jù)表達(dá)譜，包括380 例癌組織和50 例癌旁正常組織。使用Excel 2016和GraphPad 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Log2轉(zhuǎn)換和分析。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法 石蠟包埋經(jīng)甲醛固定的大腸癌組織標(biāo)本，組織切片機(jī)切成4 μm厚的連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精（依次100%、100%、95%、80%、70%）水化，pH 6.0的檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，一抗孵育（1:100，購自美國Abcam 公司）4℃過夜，加入生物素化二抗，室溫?fù)u床孵育1h，使用辣根過氧化氫酶（DAB）顯色劑顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

所有切片染色結(jié)果均由2 位病理科醫(yī)師隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：0分：不染色；1分：弱染色（淡黃色）；2分：中染色（黃棕色）；3 分：強(qiáng)染色（棕褐色）。腫瘤細(xì)胞陽性率評(píng)分如下：0 分：無陽性腫瘤細(xì)胞；1 分：＜25%的陽性腫瘤細(xì)胞；2 分：25%～50%的陽性腫瘤細(xì)胞；3 分：50%～75%的陽性腫瘤細(xì)胞；4分：≥75%的陽性腫瘤細(xì)胞。通過將陽性腫瘤細(xì)胞的百分比和染色分?jǐn)?shù)的乘積作為最終染色指數(shù)（SI）。根據(jù)此方法，SI≥4的切片定義為高表達(dá)，SI＜4為低表達(dá)，SI=0為陰性表達(dá)。

1.2.3 隨訪 隨訪主要通過復(fù)診、電話、微信等方式進(jìn)行，以大腸癌確診時(shí)間為起點(diǎn)，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、死亡或末次隨訪時(shí)間為觀察終止時(shí)間點(diǎn)，截止時(shí)間為2017年12月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)分析KIF20A表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的相關(guān)性；用Kaplan-Meier檢驗(yàn)繪制生存曲線；Log-Rank檢驗(yàn)和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分別進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌與癌旁正常組織中KIF20A差異表達(dá)

對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中KIF20A在大腸癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，KIF20A在大腸癌組織中的mRNA 表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1A）。在配對(duì)癌組織與癌旁正常組織中，KIF20A 在大腸癌組織中的mRNA 表達(dá)水平同樣顯著高于癌旁正常組織（P＜0.001，圖1B）。

圖1 大腸癌與癌旁正常組織中KIF20A差異表達(dá)

2.2 KIF20A 差異表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性

大腸癌組織中KIF20A的蛋白表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、腫瘤位置無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。而與腫瘤浸潤深度（T分期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M分期）、TNM分期有顯著相關(guān)性（P＜0.05，表1）。

2.3 KIF20A 在大腸癌組織與癌旁正常組織中的蛋白表達(dá)水平

采用免疫組織化學(xué)法分析KIF20A在大腸癌組織和配對(duì)癌旁正常組織中的蛋白表達(dá)水平。105 例患者中，64%（67/105）大腸癌組織KIF20A 顯著高表達(dá)，36%（38/105）患者呈陰性或低表達(dá)（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KIF20A表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈團(tuán)片狀分布，染色強(qiáng)度深淺不一（圖2A，B）。

2.4 KIF20A差異表達(dá)與患者預(yù)后之間的相關(guān)性

與KIF20A低表達(dá)的患者相比，KIF20A高表達(dá)的患者總體生存時(shí)間顯著縮短（P＜0.001，圖2C）。KIF20A高表達(dá)患者較低表達(dá)患者的無復(fù)發(fā)生存時(shí)間也明顯縮短差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖2D）。單因素分析結(jié)果顯示腫瘤大小、分化程度、T 分期、N分期、M 分期、TNM 分期、KIF20A 表達(dá)與預(yù)后均具有相關(guān)性（P＜0.05）；而患者性別、年齡、腫瘤位置與預(yù)后無相關(guān)性（P＞0.05）。Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示KIF20A表達(dá)是影響大腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05，表2，3）。

表1 105例大腸癌患者臨床病理參數(shù)與KIF20A表達(dá)的相關(guān)性

表1 105例大腸癌患者臨床病理參數(shù)與KIF20A表達(dá)的相關(guān)性（續(xù)表1）

圖2 免疫組織化學(xué)法分析KIF20A在大腸癌組織與癌旁正常組織中的蛋白表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系

表2 總體生存期的單因素和多因素Cox回歸分析

表2 總體生存期的單因素和多因素Cox回歸分析（續(xù)表2）

表3 無復(fù)發(fā)生存期的單因素和多因素Cox回歸分析

3 討論

驅(qū)動(dòng)蛋白家族作為具有ATP 酶活性的微管馬達(dá)蛋白，是一類在生物物種進(jìn)化過程中高度保守的多基因家族，于1985年在魷魚的神經(jīng)元軸突中首次被發(fā)現(xiàn)［16］。KIF20A（也稱RAB6KIFL，the Rab6-binding kinesin）作為驅(qū)動(dòng)蛋白家族的一員，最先發(fā)現(xiàn)定位于高爾基體中，并通過與GDP-bound 形式的Rab6 相互作用在細(xì)胞動(dòng)力學(xué)中發(fā)揮重要功能［17］。KIF20A通過與微管結(jié)合，水解ATP產(chǎn)生機(jī)械能，主要干擾細(xì)胞有絲分裂過程［5］。KIF20A的異常表達(dá)主要是通過干擾細(xì)胞有絲分裂過程中紡錘體的形成和染色體的分離，從而形成多倍體，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，影響患者的預(yù)后。

近年研究表明，KIF20A在胰腺癌組織中高表達(dá)，沉默KIF20A表達(dá)可顯著抑制胰腺癌的侵襲和遷移能力，提示KIF20A 可能具有某種癌基因特性［12］。本研究通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中KIF20A 在大腸癌中的mRNA 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，KIF20A在大腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)105 例大腸癌患者組織中KIF20A的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明KIF20A在大腸癌組織中高表達(dá)，在癌旁正常組織中低表達(dá)或陰性表達(dá)，提示KIF20A 可能在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著癌基因的角色，促進(jìn)大腸癌進(jìn)展。

越來越多的證據(jù)表明，KIF20A 在惡性腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究報(bào)道敲除KIF20A能夠有效抑制胃癌細(xì)胞活性，誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂（G2/M 期）阻滯，并增強(qiáng)抗癌藥物的敏感性，有助于改善患者預(yù)后［18］。Yamashita 等［6］證實(shí)KIF20A 高表達(dá)的惡性黑色素瘤患者無復(fù)發(fā)生存期縮短，提示是一種新型的黑色素相關(guān)抗原，表明KIF20A 是一種有助于黑色素瘤診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的重要指標(biāo)。有研究顯示，KIF20A在乳腺癌中的過表達(dá)與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性有關(guān)，被認(rèn)為是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)［19］。但是其潛在的分子機(jī)制尚不清楚，KIF20A 與大腸癌的關(guān)系也尚不明確。

本研究進(jìn)一步分析KIF20A表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)KIF20A 蛋白表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、腫瘤位置無相關(guān)性，而與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM 分期有顯著相關(guān)。提示KIF20A 蛋白陽性表達(dá)的患者通常腫瘤浸潤深度更深，TNM分期更晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性更大，這些結(jié)果表明KIF20A表達(dá)可能與大腸癌疾病進(jìn)展有關(guān)。生存分析結(jié)果顯示KIF20A 高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)，與Liu等［9］報(bào)道一致。Cox回歸分析進(jìn)一步表明KIF20A是影響大腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能作為預(yù)測(cè)大腸癌不良預(yù)后的重要標(biāo)志物。

綜上所述，本研究結(jié)果提示KIF20A 在大腸癌進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用，其高表達(dá)預(yù)示著大腸癌患者預(yù)后不良，可作為診斷大腸癌的生物標(biāo)志物及預(yù)測(cè)預(yù)后的重要因子，為大腸癌患者的早期診斷及預(yù)后評(píng)估提供新的理論依據(jù)。但KIF20A在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。