陳旭昕 汪文婧 胥頡 唐儉 孟激光 韓志海

1中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心呼吸與危重癥醫(yī)學科（北京100048）；2安慶市立醫(yī)院心胸外科監(jiān)護病房（安徽安慶246003）；3黑龍江省大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科（黑龍江大慶166200）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）及急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床常見的急危重癥，目前缺乏特異性治療手段，病死率仍居高不下［1-2］。肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cell，PVEC）對于維持肺泡-毛細血管膜的功能、肺泡水腫液的清除至關(guān)重要，PVEC 廣泛損傷將加速ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展［3-4］。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）來源廣，可從骨髓、脂肪組織、臍帶血、皮膚、肌肉、肌腱及牙髓等組織中獲得［5］。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BM-MSC）在急性肺損傷動物模型中有治療作用［6］，體外實驗也證實BMMSC 對PVEC 具有保護作用［7］，但具體的機制尚未完全明了，可否通過調(diào)控PVEC 細胞周期來發(fā)揮保護作用尚無直接證據(jù)。因此，本研究擬利用Transwell共培養(yǎng)體系，用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激PVEC，觀察BM-MSC 對PVEC 細胞增殖及周期的影響，并分析細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴激酶4（Cyclin-dependent kinase 4，CDK4）及P27的表達水平，以期為BM-MSC 在ALI/ARDS 治療中的應用提供更多實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑人源性BM-MSC 細胞來源于廣州賽業(yè)生物科技有限公司，由提供商完成干細胞免疫表型及多能分化潛能鑒定。人源性PVEC 細胞來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫。LPS（Ecoil 0111：B4）購于美國Sigma。DMEM/F12 培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清均購于GIBCO 公司。CCK-8 試劑盒及細胞周期檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)公司。Trizol 來源于美國Invitrogen 公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光實時定量PCR 試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。Transwell 細胞共培養(yǎng)板（含0.4 μm 孔徑濾膜）購置美國康寧公司。其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 人BM-MSC 及PVEC 細胞培養(yǎng)人BM-MSC及PVEC 細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：37 ℃、5% CO2及95%濕度。每隔1 d 換液1次，2～3 d 傳代1次。實驗用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3 細胞共培養(yǎng)及分組處理BM-MSC 與PVEC細胞共培養(yǎng)于Transwell 共培養(yǎng)體系中。Transwell 體系的上室接種BM-MSC（1 × 105/孔），而在下室接種PVEC（2 × 103/孔），建立共培養(yǎng)體系，同上條件常規(guī)培養(yǎng)。實驗分4 組：A 組：正常PVEC 組，PVEC 細胞常規(guī)培養(yǎng)不予以任何刺激；B 組：PVEC+LPS 組，PVEC 細胞常規(guī)培養(yǎng)同時給予終濃度為0.1 mg/mL的LPS 刺激6 h；C組：PVEC/BM-MSC+LPS 組，將BM-MSC 與PVEC細胞共培養(yǎng)于Transwell 體系過夜后給予0.1 mg/mL的LPS 刺激6 h；D 組：PVEC/BM-MSC + PBS組，同上將BM-MSC 與PVEC 細胞共培養(yǎng)于Transwell 體系過夜后，用等體積的PBS 代替LPS，再孵育6 h。

1.4 CCK8 法檢測PVEC 細胞增殖情況細胞增殖實驗中采用96 孔的Transwell 共培養(yǎng)板，同上分組及處理細胞，在結(jié)束培養(yǎng)前，每孔中加入10 μL CCK8 溶液。并設(shè)立3個復孔及空白對照孔。加入CCK8 溶液后繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用酶標儀測各孔波長在450 nm的吸光度值，以吸光度值表示細胞的增殖水平。

1.5 PVEC 細胞周期檢測細胞周期檢測實驗中采用6 孔的Transwell 共培養(yǎng)板，同上分組及處理細胞。培養(yǎng)結(jié)束時，常規(guī)消化處于下室的PVEC 細胞，PBS 洗滌細胞后，用4 ℃的70%（v/v）固定細胞12 h。加入等體積的PBS 洗滌兩遍，再加入終濃度20 μg/mL的RNase，37 ℃水浴1 h，離心去上清，懸浮于PI 染液中，室溫下避光染色15 min，流式細胞儀檢測，MCYCLE 軟件分析細胞周期。

1.6 PVEC 細胞內(nèi)CyclinD1、CDK4 及P27 mRNA表達水平檢測同時處理并收集PVEC 細胞，按5×106個細胞加入1 mL Trizol的比例加入Trizol 并混勻。Trizol 一步抽提法提取總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄，并按實時定量PCR 試劑盒說明進行PCR，PCR 條件如下：95 ℃，預變性30 s；隨后進行40個循環(huán)PCR 反應（95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s）；60 ℃延伸30 s；最后60～95 ℃進行熔解曲線檢測。以β-actin 作為內(nèi)參基因。目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法進行定量分析。擴增引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列如下：β-actin：5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′（正義鏈），5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′（反義鏈）；Cyclin D1：5′-GATGCCAACCTCCTCAACGAC-3′（正義鏈），5′-CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC-3′（反義鏈）；CDK4：5′-ACCAGATGGCACTTACACCC-3′（正義鏈），5′-TCCACAGAAGAGAGGCTTTCG-3′（反義鏈）；P27：5′-CTCTGAGGACACGCATTTGGTGGA-3′（正義鏈），5′-GGCATTTGGGGAACCGTCTGAAAC-3′（反義鏈）。

1.7 統(tǒng)計學方法應用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用SNK 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BM-MSC共培養(yǎng)對PVEC細胞增殖的影響與A 組相比，B，C 及D 組的細胞增殖率下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而與B 組比較，與BMMSC 共培養(yǎng)的C，D 組細胞增殖率提高，而與A 組比較，D 組的細胞增殖率升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組PVEC的細胞生長曲線Fig.1 The cell growth curve of PVECs in each group

2.2 BM-MSC共培養(yǎng)對PVEC細胞周期的影響A 組細胞周期分析顯示：S 期細胞比例為（30.17±0.98）%，（G1+G2）期細胞比例為（69.83±0.98）%；而B 組細胞，S 期細胞比例顯著減少為（15.77±0.77）%，（G1 + G2）期細胞比例顯著增加為（84.22±0.77）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；BM-MSC共培養(yǎng)則可緩解LPS 誘發(fā)的（G1+G2）期細胞比例的增加以及S 期細胞比例的減少，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。而D 組與A 組比較，S 期細胞比例進一步增加為（34.48±0.65）%，（G1 + G2）期細胞比例進一步下降為（65.53±0.65）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測細胞周期Fig.2 Analysis of cell cycle by flow cytometry

2.3 BM-MSC 共培養(yǎng)對PVEC 中細胞周期相關(guān)蛋白mRNA 表達水平的影響與A 組相比，B 組細胞內(nèi)P27 mRNA 表達水平顯著上升，而CyclinD1及CDK4 mRNA 表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而在C 組，P27 mRNA 增加和CyclinD1及CDK4 mRNA 減少的程度均較B 組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而與A 組比較，D 組的CyclinD1 及CDK4 mRNA 增加和P27 mRNA 下降的程度，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

PVEC 是肺泡-毛細血管膜重要的組成細胞，在維持肺內(nèi)環(huán)境的平衡與穩(wěn)定中起重要作用［8］。PVEC 通透性的增加將加速肺泡水腫液的形成及炎癥細胞浸潤［9］。本研究首次從細胞周期阻滯角度闡述了BM-MSC 對PVEC的保護機制，結(jié)果顯示與BM-MSC 共培養(yǎng)可減輕LPS 對PVEC 增殖的抑制作用以及周期的阻滯效應，這可能與調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4 及P27的表達有關(guān)。

圖3 實時定量RT-PCR 檢測PVEC 細胞內(nèi)CyclinD1、CDK4及P27 mRNA 表達Fig.3 Analysis of CyclinD1，CDK4 and P27 mRNA levels in PVECs by qRT-PCR

細胞周期是指從細胞分裂產(chǎn)生的新細胞開始到下一次分裂形成細胞結(jié)束為止所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段［10-11］。細胞周期中存在G1/S和G2/M 兩個重要的調(diào)控阻滯點，一旦細胞將不能從一個階段轉(zhuǎn)向下一個階段將發(fā)生細胞周期阻滯，從而導致細胞無法增殖更新［12-13］。肺泡-毛細血管膜的修復需要肺血管內(nèi)皮細胞增殖，而細胞增殖依賴于細胞周期的循環(huán)。調(diào)控細胞周期或細胞周期相關(guān)蛋白可作為ALI/ARDS的治療靶點［14］。本研究發(fā)現(xiàn)與BM-MSC共培養(yǎng)后，PVEC的S期細胞比例上升，而（G1+G2）期的細胞比例減少，這可能是BM-MSC共培養(yǎng)促進PVEC細胞增殖的機制之一。

細胞周期正性調(diào)控蛋白包括Cyclin和CDK［15］。細胞能否通過調(diào)控阻滯點而進入細胞自主分裂程序，很大程度取決于G1 期內(nèi)CyclinD1的積累，上調(diào)CyclinD1及CDK4的表達可推動細胞通過調(diào)控阻滯點，而阻滯CyclinD1 及CDK4的表達可使細胞不能從G1 期進入S 期［16］。而P27 是重要的細胞周期負性調(diào)控因子［17］。P27 可與Cyclin 結(jié)合而對Cyclin/CDK 復合物起抑制作用，最終抑制細胞周期的循環(huán)［18］。本研究結(jié)果顯示，與BM-MSC 共培養(yǎng)后促進CyclinD1及CDK4的表達，而減少P27的表達。目前BM-MSC 發(fā)揮效應的主要機制被認為與其旁分泌功能有關(guān)［19］，本研究中采用的是Transwell 細胞非直接接觸共培養(yǎng)體系，因此筆者推測BM-MSC 亦可能是通過旁分泌機制對細胞周期相關(guān)蛋白進行調(diào)控，具體通過何種旁分泌因子來實施對細胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)控尚有待進一步研究探索。

此外，本研究顯示，在非炎癥刺激環(huán)境下BMMSC 共培養(yǎng)對PVEC的增殖、細胞周期及細胞周期相關(guān)蛋白也有正性調(diào)控作用，這可能與BM-MSC在靜息狀態(tài)下亦能旁分泌可溶性有益因子有關(guān)［20］。后續(xù)實驗將考慮采用細胞因子陣列分析等手段來檢測可溶性細胞因子的差異表達，以進一步探索發(fā)揮此效應主要歸因于何種細胞因子。

綜上，BM-MSC 對PVEC 細胞存在保護作用，促進PVEC 在炎癥刺激環(huán)境下增殖，抵制細胞周期阻滯以及調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白表達是可能的分子機制，實驗結(jié)果為進一步明確BM-MSC的保護機制提供了實驗室依據(jù)。