徐小芳 梁趙良 曾睿智 呂曉丹 劉耿峰 呂小平

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（南寧530021）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）主要分為潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn′s disease，CD）兩種類型，其發(fā)病率在全球呈上升趨勢，我國的發(fā)病率也正逐年上升［1］。IBD的病因尚不明確［2］，普遍認為是腸道的上皮細胞、共生的微生物群、黏膜免疫系統(tǒng)之間的三者關(guān)系失調(diào)導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生，這三者又受到遺傳和環(huán)境因素的影響［3］。

目前已證實了200多個IBD易感性基因位點［4］，其中大多數(shù)是在基因編碼區(qū)。LIBIOULLE等［5］發(fā)現(xiàn)5p13.1 基因多態(tài)性與CD的易感性有關(guān)，它是一段1.25-MB的基因非編碼區(qū)，與CD 相關(guān)的遺傳變異能上調(diào)PTGER4的表達水平，其中rs4495224和rs7720838 基因多態(tài)性與CD 關(guān)系較強，對PTGER4表達的影響最為顯著，常將PTGER4基因作為CD的易感基因。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PTGER4與早發(fā)型UC易感性有關(guān)［6］。PTGER4基因可以編碼產(chǎn)生EP4亞基［7］，EP4 作為前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的受體與其結(jié)合導(dǎo)致了白細胞的募集和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，參與了腸道炎癥的發(fā)生和緩解作用［8］。近年來，非基因編碼區(qū)的疾病易感基因越來越受到關(guān)注，研究［9］表明非編碼RNA 在炎癥性腸病細胞免疫調(diào)節(jié)起重要作用。目前該基因多態(tài)性與IBD的研究國內(nèi)外報道尚不一致，GLAS等［10］、PRAGE等［11］發(fā)現(xiàn)rs4495224和rs7720838 基因多態(tài)性與法國、比利時、德國、北美人群CD的易感性有關(guān)，與UC 無關(guān)。但在日本人群并未發(fā)現(xiàn)以上兩個位點與IBD 有關(guān)［12］。郭政等［13］通過Meta分析發(fā)現(xiàn)rs4495224 基因多態(tài)性與CD 無明顯關(guān)聯(lián)。我國尚無該基因多態(tài)性與IBD 相關(guān)的臨床研究報道，廣西是我國壯族人口最大的聚居地，壯族、漢族人群擁有不同的疾病遺傳性［14］。本研究目的是探討PTGER4rs4495224和rs7720838 多態(tài)性與廣西壯族、漢族人群IBD 以及臨床特征的相關(guān)性，為IBD的基因診斷及治療提供線索。

1 資料和方法

1.1 臨床資料收集2014年5月至2018年11月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一、第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科門診、住院的廣西區(qū)域無血緣關(guān)系的IBD 患者212例（UC 組：壯族59例，漢族69例；CD 組：壯族40例，漢族44例）。IBD的診斷符合2018年制定的《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》的診斷標準［15］，并排除患有其他自身免疫性疾病、感染性腸炎患者。另收集廣西區(qū)域無血緣關(guān)系的健康對照者190例（壯族90例，漢族100例）。納入對象為同期就診于廣西醫(yī)科大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院，均已排除腫瘤、自身免疫性疾病及IBD 家族史的健康體檢者。IBD 組和正常對照組年齡及性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。標本采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準和患者本人或家屬知情同意。

1.2 研究方法（1）DNA 提?。翰捎肈NA 試劑盒提取腸黏膜DNA。（2）位點的選擇：從NCBI 獲取SNP 信息，選擇的SNP 最小等位基因頻率（MAF）＞15%，結(jié)合文獻報道，所選SNP 可能與CD的并發(fā)癥有關(guān)。（3）PCR 擴增：①引物設(shè)計：根據(jù)NCBI 基因數(shù)據(jù)庫設(shè)計rs4495224和rs7720838 位點引物，序列見表1。②PCR 反應(yīng)體系：DNA2 μL+上下游引物各1 μL + Master Mix 25 μL + RNase-free Water 21 μL。③反應(yīng)條件：變性94 ℃、30 s，退火50 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，共30個循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸7 min。④基因測序：電泳鑒定目的片段，并將PCR產(chǎn)物送測序，用Chromas 軟件判讀基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。統(tǒng)計rs4495224和rs7720838 位點的基因型及等位基因頻率，采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡性檢驗，P＞0.05 提示具有群體代表性。用χ2檢驗或Fisher 確切概率法檢驗比較組間各基因型和等位基因頻率以及分析基因多態(tài)性與臨床特征的差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 rs4495224 基因多態(tài)性分析結(jié)果PCR 產(chǎn)物電泳條帶與目的片段大小一致。測序結(jié)果與Gen-Bank 基因庫上序列一致。共得到3種基因型：野生型純合子CC 型、突變型雜合子AC 型和突變型純合子AA 型。

基因型及等位基因頻率分布見表2、3。各組基因型及等位頻率分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），具有群體代表性。漢族CD 組突變基因型（AA+AC）頻率、A 突變等位基因頻率明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002；P=0.001）；壯族UC 組、CD 組、漢族UC 組分別與正常對照組比較、壯族CD 組與漢族CD 組比較、壯族CD 組與漢族CD 組比較基因型及等位基因頻率分布均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；進一步分析rs4495224 多態(tài)性與漢族CD 臨床特征（病變部位、疾病活動性、有無并發(fā)癥）的關(guān)系，CD 病變部位分為：回腸末段（L1）、結(jié)腸（L2）、回結(jié)腸（L3）；依據(jù)簡化克羅恩活動指數(shù)計算法將疾病活動性分為：緩解期、活動期；并發(fā)癥包括：瘺管、腹腔膿腫、腸腔狹窄和腸梗阻、肛周病變等［15］。在漢族CD的不同病變部位、疾病活動性、有無并發(fā)癥其基因型和等位基因頻率的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 rs7720838 基因多態(tài)性分析結(jié)果PCR 產(chǎn)物電泳條帶與目的片段大小一致。測序結(jié)果與Gen-Bank 基因庫上序列一致。共得到3種基因型：野生型GG 型、雜合子突變TG 型和純合子突變TT 型。

基因型頻率及等位基因頻率分布見表4、5。各組基因型及等位頻率分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），具有群體代表性。漢族CD組突變基因型（TT + TG）頻率、T等位基因頻率明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.015；P=0.006）；漢族CD 組T等位基因頻率（29.5%）高于壯族CD 組（15%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.028），二者的基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。壯族UC 組、CD 組、漢族UC 組分別與正常組比較、壯族UC 組與漢族UC 比較基因型及等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在漢族CD 患者的不同病變部位、疾病活動性、有無并發(fā)癥中基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 rs4495224 病例組與對照組基因型頻率和等位基因頻率Tab.2 rs4495224 genotype and allele frequency in case group and control group

表3 rs4495224 漢族CD 組基因-臨床特征分析Tab.3 rs4495224 gene-clinical characteristics analysis in Han CD group

3 討論

PTGER4基因編碼產(chǎn)生PGE2的受體EP4 亞基，其廣泛表達于骨髓、結(jié)腸、小腸、胃等組織。PGE2 是花生四烯酸（arachidonicacid，AA）以環(huán)氧合酶（COX）為限速酶而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物之一，它通過與四種受體亞型（EP1-EP4）結(jié)合，參與急性炎癥和炎癥性免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展［8］。既往研究發(fā)現(xiàn)PGE2的促炎作用主要通過EP1和EP3受體介導(dǎo)，EP4 通過激活抗凋亡和增殖信號通路，對結(jié)腸上皮細胞的存活和再生有重要作用［16］，NAKASE等［17］發(fā)現(xiàn)EP4 激動劑能抑制結(jié)腸炎發(fā)展并促進粘膜愈合。但有研究發(fā)現(xiàn)，PGE 2 可以通過EP2/Ep4 受體增加IL-12和IFN-γ信號通路促進Th1細胞分化；通過IL-1β和IL-23 通路促進體外Th17細胞增殖［8］。既往研究報道Th1、Th17 這兩種輔助性T 細胞和IBD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［18］。另外，GLAS等［10］發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）和X 盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）可能分別與5p13.1某基因組區(qū)域結(jié)合從而上調(diào)PTGER4表達進而影響IBD的發(fā)病。其中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 參與多種炎癥信號通路［19］，腸上皮細胞中XBP1的缺失導(dǎo)致自發(fā)性腸炎［20］，二者都參與IBD的發(fā)病。近年來PTGER4基因被發(fā)現(xiàn)與多種其他自身免疫性疾病有關(guān)，如強直性脊柱炎（rs7726237）［21］、多發(fā)性硬化癥（rs9292777）［22］、類風濕關(guān)節(jié)炎（rs76523431）［23］等，其發(fā)病機制可能是PGE2 在體內(nèi)通過EP4 受體促進輔助性T 細胞的功能，促發(fā)免疫炎癥的發(fā)生。研究［24］表明使用EP4 選擇性拮抗劑可減少局部淋巴結(jié)中Th1和Th17 細胞的積累，并抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎或接觸性過敏小鼠的疾病進展。因此EP4 拮抗作用可能是治療難治性免疫疾病的良好藥物靶點。

表4 rs7720838 病例組與對照組基因型頻率和等位基因頻率Tab.4 rs7720838 gnotype and allele frequency in case group and control group

表5 rs7720838 漢族CD 組與基因-臨床特征分析Tab.5 rs7720838 gene-clinical characteristics analysis in Han CD group

本研究發(fā)現(xiàn)PTGER4基因rs4495224和rs7720838多態(tài)性與廣西漢族人群CD的易感性相關(guān)，但與壯族CD、漢族和壯族UC 無關(guān)。rs4495224 A和rs7720838 T 危險等位基因可能增加漢族CD 人群PTGER4的表達，ER4 受體增加與PGE2 結(jié)合促進Th1 細胞分化、Th17 細胞增殖，各種促炎因子如IFN-γ、TNF-α、IL-17等分泌增加參與CD的病理改變。本研究中漢族的研究結(jié)果與LIBIOULLE等［5］、GLAS等［10］、PRAGE等［11］的報道一致，但與日本人群的報道相悖。漢族與壯族CD 組的基因型和等位基因頻率對比，發(fā)現(xiàn)攜帶rs7720838 T等位基因的漢族人群患CD 風險比壯族高，但在rs4495224中并無此發(fā)現(xiàn)。中國是一個有56個民族的國家，相同種族不同民族IBD的發(fā)病率和患病率存在差異，唐源等［25］發(fā)現(xiàn)在云南省18個不同少數(shù)民族中，漢族人群的總患病率和UC 患病率均最高。本研究中漢族和壯族的結(jié)果不同可能是不同民族受個體遺傳背景影響，也可能與不同民族的經(jīng)濟發(fā)展水平、居住環(huán)境和生活習慣不同有關(guān)。本研究基因-臨床特征分析顯示，rs4495224和rs7720838基因多態(tài)性與廣西漢族CD的病變部位、疾病活動度、有無并發(fā)癥無關(guān)聯(lián)，這一結(jié)果與GLAS等［10］、PRAGE等［11］關(guān)于基因-臨床特征、基因-基因的關(guān)系研究不一致。這些結(jié)論受到小樣本和地理區(qū)域的限制，還需要進一步研究。本研究未發(fā)現(xiàn)rs4495224和rs7720838 與漢族UC 及壯族UC和CD發(fā)病相關(guān)，因此沒有進一步研究基因多態(tài)性與臨床特征的關(guān)系。

綜上，PTGER4基因rs4495224和rs7720838 多態(tài)性可能與廣西漢族人群CD 易感性有關(guān)，可能與漢族CD的病變部位、疾病活動性、有無并發(fā)癥無關(guān)，可能與漢族UC、壯族CD 及UC 易感性無關(guān)；攜帶rs7720838 T 突變等位基因的漢族人群患CD 風險可能比壯族高。然而本研究樣本量較少、所納入的臨床特征分組過少、漢族與壯族人群的結(jié)果不一致，尚不能得出可靠結(jié)論，還需更大規(guī)模的研究去證實；由于CD 病因和發(fā)病機制復(fù)雜，后續(xù)工作需進一步研究PTGER4基因具體通過何種途徑參與CD 炎癥病理性改變。