孫夢(mèng)利 王世豪 徐子健 江雪飛 孫化鵬

摘? 要? 為探究外源海藻糖對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，本研究以西瓜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為試材，測(cè)定外源海藻糖預(yù)處理后，滲透脅迫對(duì)西瓜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)量、細(xì)胞外pH、細(xì)胞內(nèi)ROS（活性氧簇）相對(duì)含量和微管骨架的影響。結(jié)果表明：滲透脅迫下西瓜細(xì)胞的生長(zhǎng)量明顯受到抑制，并且滲透脅迫可誘導(dǎo)西瓜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)外體堿化，ROS迸發(fā)，細(xì)胞微管骨架發(fā)生解聚;外源添加海藻糖可在一定程度上緩解滲透脅迫對(duì)西瓜懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量的抑制作用，調(diào)節(jié)pH、ROS表達(dá)水平、并維持微管骨架結(jié)構(gòu)的完整性。以上研究結(jié)果表明滲透脅迫下，海藻糖對(duì)西瓜細(xì)胞具有維持細(xì)胞生長(zhǎng)、保護(hù)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)抗性反應(yīng)的功能。

關(guān)鍵詞? 西瓜;滲透脅迫;海藻糖;活性氧;微管骨架

中圖分類號(hào)? Q945.78? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中不可避免地遭受多種生物和非生物脅迫的影響，其中干旱、鹽堿、低溫是影響植物生長(zhǎng)常見的三大非生物脅迫因素，三者在植物生理上均會(huì)導(dǎo)致植物水分匱乏、細(xì)胞失水，從而造成滲透脅迫[1]。滲透脅迫下植物體內(nèi)會(huì)發(fā)生多種變化，如Lei等[2]發(fā)現(xiàn)滲透脅迫下小麥幼苗的相對(duì)水分含量會(huì)降低;馬廷臣等[3]利用PEG-6000模擬干旱處理2種水稻幼苗材料，發(fā)現(xiàn)脅迫處理下兩種水稻的根體積、根粗、根長(zhǎng)、根系質(zhì)膜相對(duì)透性和POD活性等生理指標(biāo)均受到嚴(yán)重影響;另有研究表明，在非生物脅迫條件下，植物體內(nèi)活性氧的生成和消除處于平衡狀態(tài)，但隨著滲透脅迫程度的加深和時(shí)間延長(zhǎng)，活性氧大量積累，膜脂過氧化加劇，水稻葉片質(zhì)膜透性增加，丙二醛（MDA）含量顯著提升，造成膜系統(tǒng)和多種酶損傷[4]。此外，滲透脅迫還會(huì)改變植物的葉綠素結(jié)構(gòu)，使光合色素發(fā)生降解，光合電子系統(tǒng)受到破壞，光合作用受損[5]。

然而植物作為固著型生物，在長(zhǎng)期的逆境環(huán)境中往往會(huì)形成相應(yīng)的響應(yīng)機(jī)制。即植物為適應(yīng)滲透脅迫環(huán)境，細(xì)胞常常通過在體內(nèi)積累溶質(zhì)來增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)以降低水勢(shì)，維持植物體內(nèi)的水分平衡，從而降低滲透勢(shì)，保證作物的正常生長(zhǎng)[6]。海藻糖（Trehalose）就是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，近年來有關(guān)海藻糖的研究也比較多。海藻糖是由兩分子葡萄糖殘基以α，α-1，1-糖苷鍵連接而成，具有特殊性質(zhì)的非還原二糖[7]，其廣泛存在于除脊椎動(dòng)物外的許多生物中，此外，因其穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及特殊的物理性質(zhì)[8]，海藻糖成為了一種重要的抗逆化合物[9-10]，幫助生物細(xì)胞在極端條件下維持核酸、蛋白以及生物膜的活性，并保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)[7]。許多微生物、低等動(dòng)、植物在遭受不良生活環(huán)境時(shí)，細(xì)胞內(nèi)通過體內(nèi)調(diào)節(jié)合成海藻糖以抵御逆境脅迫。此外，外源添加海藻糖也能較好保護(hù)細(xì)胞、生物體及生物大分子。目前已在水稻[11]、小麥[12]、油菜[13]、黑麥草[14]、番茄[15]、海錦葵[16]等植物中得到驗(yàn)證，主要體現(xiàn)在抗離子滲透、干旱、高溫、低溫脅迫等方面。

外源添加海藻糖對(duì)植物的保護(hù)作用多體現(xiàn)在植株方面，在細(xì)胞水平上，外源海藻糖對(duì)滲透脅迫下細(xì)胞的保護(hù)作用的研究鮮有報(bào)道。據(jù)此，本研究以西瓜懸浮細(xì)胞系為試驗(yàn)材料，通過測(cè)定和觀察外源海藻糖對(duì)滲透脅迫下西瓜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)量、西瓜細(xì)胞外pH、細(xì)胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞微管骨架結(jié)構(gòu)的變化，初步了解滲透脅迫對(duì)西瓜細(xì)胞的影響和外源海藻糖對(duì)西瓜細(xì)胞的保護(hù)作用，為后期進(jìn)一步研究海藻糖對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

選用“FR-32-1B-2n”二倍體西瓜的懸浮細(xì)胞系為材料，細(xì)胞系通過誘導(dǎo)西瓜葉片愈傷組織建立，繼代周期為7 d。

1.2? 方法

1.2.1? 主要試劑配制方法? （1）甘露醇（Mannitol，Sigma-Aldrich， 上海）：用MS培養(yǎng)基（Phytotechnology laboratories，美國(guó)）做溶劑，工作濃度為100 mmol/L，121 ℃滅菌30 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）海藻糖（Sigma-Aldrich，上海）：用超純水配制，工作濃度為10 mmol/L，用0.22 μm濾膜過濾滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）Dihydrorhodamine123（DHR123）（Sigma- Aldrich，上海）：用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制，工作濃度10 μmol/L，20 ℃避光保存。

1.2.2? 西瓜懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量的測(cè)定? 分別以100 mmol/L甘露醇、10 mmol/L海藻糖+ 100 mmol/L甘露醇處理西瓜懸浮細(xì)胞，設(shè)不加任何處理培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照（CK），處理后細(xì)胞置于150 r/min搖床，25 ℃暗培養(yǎng)7 d，參照Ismail等[17]的方法測(cè)定△PCV（Packed cell volume），并用以表示西瓜懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量，△PCV=沉淀細(xì)胞體積（VC）/總細(xì)胞體積（VT），其中對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)量定為100%。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3? 西瓜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基pH的測(cè)定? 吸取2 mL西瓜懸浮細(xì)胞于青霉素瓶中，置于150 r/min搖床上平衡穩(wěn)定后，參照Qiao等[18]的方法，使用梅特利-托利多pH計(jì)測(cè)定不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞外pH變化，并將對(duì)照組的pH計(jì)為1，計(jì)算處理的相對(duì)pH。

1.2.4? 西瓜懸浮細(xì)胞ROS的測(cè)定? 吸取1.5 mL處于指數(shù)增長(zhǎng)期的懸浮細(xì)胞于離心管中，置于150 r/min搖床25 ℃下穩(wěn)定培養(yǎng)30 min，然后用MS培養(yǎng)液洗脫后預(yù)平衡1 h，用終濃度10 μmol/L的DHR123染色，染色孵育洗脫后，處理細(xì)胞30 min，然后參考Chang等[19]的熒光顯微觀察法，測(cè)定不同處理下西瓜懸浮細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化。即吸取處理后細(xì)胞置于載玻片上，同時(shí)進(jìn)行明場(chǎng)和熒光顯微觀察及拍照，通過計(jì)算整個(gè)細(xì)胞面積的熒光強(qiáng)度與整幅面積的熒光強(qiáng)度的比值，得到ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.2.5? 西瓜懸浮細(xì)胞微管熒光免疫顯微觀察? 吸取1.5 mL處于指數(shù)增長(zhǎng)期的西瓜懸浮細(xì)胞于2 mL離心管中，分別用對(duì)照組、100 mmol/L甘露醇和10 mmol/L海藻糖（預(yù)處理12 h）+100 mmol/L甘露醇處理細(xì)胞1 h。按參考喬飛等[20]的方法，對(duì)處理后細(xì)胞依次進(jìn)行固定、酶解、封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)、特異抗體[一抗anti-α-Tubulin DM1A （Sigma-Aldrich）]與抗原的結(jié)合、二抗[FITC- conjugated antibody（Sigma-Aldrich）]與一抗結(jié)合，保濕溫育洗脫，使用Leica SP8激光共聚焦熒光顯微鏡，在40倍物鏡下對(duì)其細(xì)胞微管骨架進(jìn)行GFP觀察并拍照。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用WPS Office中的 Excel軟件進(jìn)行匯總整理，并使用DPS 15.10軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)Duncan多重比較各處理組間的差異顯著性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 外源海藻糖對(duì)滲透脅迫下細(xì)胞生長(zhǎng)量的影響

植物生長(zhǎng)受到抑制是遭受逆境的表觀生理反應(yīng)。由圖1可見，與對(duì)照組相比，100 mmol/L甘露醇誘導(dǎo)處理西瓜懸浮細(xì)胞7 d后，西瓜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)量明顯下降，且下降幅度達(dá)到57.33%;此外，對(duì)照組和甘露醇處理組兩者之間的西瓜細(xì)胞生長(zhǎng)量差異達(dá)到極顯著水平（p< 0.01），說明滲透脅迫能夠抑制細(xì)胞的生長(zhǎng);進(jìn)一步通過外源添加海藻糖預(yù)處理發(fā)現(xiàn)：外源海藻糖處理組西瓜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)量是甘露醇處理組的1.97倍（p<0.01），說明外源海藻糖對(duì)甘露醇脅迫下西瓜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)量有明顯的緩解作用。

2.2? 外源海藻糖對(duì)滲透脅迫下細(xì)胞外pH的影響

質(zhì)外體堿化是植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的保護(hù)機(jī)制之一[18]，為探究外源海藻糖在滲透脅迫下對(duì)西瓜細(xì)胞外pH的影響，本研究通過測(cè)定不同處理下西瓜細(xì)胞外pH的變化情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照相不同大寫字母表示處理間差異極顯著（p<0.01），不同小寫字母表示處理間差異顯著（p<0.05）。

比，100 mmol/L甘露醇處理組的細(xì)胞外pH整體呈現(xiàn)上升后下降的趨勢(shì)，且在其誘導(dǎo)處理20 min左右細(xì)胞外pH達(dá)到最大值，此后呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但甘露醇處理組細(xì)胞外pH依然高于對(duì)照組;而加入外源海藻糖預(yù)處理后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西瓜細(xì)胞外pH整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，且其誘導(dǎo)處理20～30 min左右時(shí)，外源海藻糖對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞外pH的緩解程度最大（圖2）。說明滲透脅迫可導(dǎo)致西瓜細(xì)胞外pH升高，使西瓜細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞外堿化（質(zhì)外體堿化），而海藻糖參與質(zhì)外體堿化的調(diào)節(jié)。

2.3? 外源海藻糖對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞ROS的影響

滲透脅迫條件下會(huì)打破植物體內(nèi)活性氧代謝平衡，為闡明滲透脅迫下外源添加海藻糖對(duì)西瓜懸浮細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，首先，本研究對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞體內(nèi)ROS的含量變化進(jìn)行探究，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100 mmol/L甘露醇處理西瓜懸浮細(xì)胞30 min后，西瓜懸浮細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度以及活性氧相對(duì)含量明顯高于對(duì)照組，是對(duì)照組的1.4倍左右，說明滲透脅迫打破了西瓜細(xì)胞體內(nèi)的活性代謝平衡，導(dǎo)致活性氧積累;進(jìn)一步通過外源添加海藻糖發(fā)現(xiàn)，甘露醇脅迫下經(jīng)外源海藻糖預(yù)處理的西瓜懸浮細(xì)胞內(nèi)部ROS熒光強(qiáng)度以及活性氧相對(duì)含量明顯降低，說明外源海藻糖能夠緩解滲透脅迫對(duì)西瓜細(xì)胞的ROS誘導(dǎo)作用（圖3）。

2.4? 外源海藻糖對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞微管骨架的影響

為了深入了解西瓜細(xì)胞微管骨架對(duì)滲透脅迫

的應(yīng)答模式，在100 mmol/L甘露醇誘導(dǎo)處理西瓜細(xì)胞1 h后，觀察西瓜細(xì)胞微管骨架變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組西瓜細(xì)胞微管骨架呈完整的細(xì)平行束排列（圖4A），甘露醇處理組的西瓜細(xì)胞微管骨架排列方向混亂，原本呈線狀的微管骨架發(fā)生了明顯的解聚、彌散（圖4B）。為進(jìn)一步探究外源海藻糖對(duì)滲透脅迫下細(xì)胞微管骨架的作用，經(jīng)外源海藻糖預(yù)處理12 h甘露醇脅迫1 h后，觀察西瓜細(xì)胞的微管骨架，結(jié)果顯示：經(jīng)外源海藻糖預(yù)處理過的西瓜懸浮細(xì)胞微管骨架結(jié)構(gòu)與對(duì)照組的細(xì)胞微管骨架基本相同，呈細(xì)平行束排列（圖4C）。說明外源海藻糖對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞微管骨架有一定的保護(hù)作用，能一定程度上緩解滲透脅迫對(duì)細(xì)胞微管骨架完整性造成的影響。

3? 討論

植物遇到滲透脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生植物組織相對(duì)含水量降低[2]、光合作用受損[4]、活性氧代謝系統(tǒng)紊亂[5]以及細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性增大等脅迫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，在甘露醇脅迫處理西瓜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞一個(gè)周期后，西瓜細(xì)胞的生長(zhǎng)量顯著降低。此外，有研究表明：細(xì)胞內(nèi)pH是細(xì)胞內(nèi)物理環(huán)境以及控制活體細(xì)胞內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)的基本指標(biāo)和重要因子[21]，逆境脅迫可改變H+流向，引起細(xì)胞內(nèi)外pH的變化，而伴隨有細(xì)胞質(zhì)酸化的培養(yǎng)基堿化是植物細(xì)胞感受外界刺激的早期反應(yīng)[22]，可誘導(dǎo)活性氧的迸發(fā)和次生代謝物質(zhì)合成及一系列防御基因的表達(dá)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)：在甘露醇誘導(dǎo)處理西瓜懸浮細(xì)胞10 min左右時(shí)，西瓜懸浮細(xì)胞外（培養(yǎng)液）pH開始迅速升高，并在其誘導(dǎo)處理后20 min左右達(dá)到最大值;與此同時(shí)，在甘露醇脅迫處理西瓜懸浮細(xì)胞30 min后細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度和相對(duì)ROS含量明顯高于對(duì)照組，進(jìn)一步說明滲透脅迫可誘導(dǎo)西瓜懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)基堿化，ROS迸發(fā)，推測(cè)其原因一方面可能是滲透脅迫下，參與植物細(xì)胞內(nèi)pH調(diào)控的有關(guān)酶基因NADP-ME（NADP蘋果酸酶），PEPCase（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）被誘導(dǎo)表達(dá)[21]，植物細(xì)胞中的糖酵解反應(yīng)被促進(jìn)及大量蘋果酸積累由此而引發(fā)的氫離子（H+）的生產(chǎn)使細(xì)胞內(nèi)趨于酸性[24]，另一方面可能是滲透脅迫導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜受損，存在于細(xì)胞膜、液泡膜質(zhì)膜上H-ATPase活性降低，導(dǎo)致質(zhì)子內(nèi)流，細(xì)胞質(zhì)酸化，質(zhì)外體堿化，促進(jìn)ROS迸發(fā)。

微管作為細(xì)胞骨架的重要組成部分，在細(xì)胞有絲分裂過程中，對(duì)紡錘體的形成、染色體的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞胞質(zhì)分裂和核膜的裂解、重聚有重要作用[25]。正常生長(zhǎng)的細(xì)胞中，微管骨架的排列方向通常是垂直于細(xì)胞的生長(zhǎng)軸[26];Komis等[27]研究發(fā)現(xiàn)小麥根尖細(xì)胞的微管骨架在高滲脅迫下微管骨架會(huì)受到破環(huán);此外，高滲溶液處理擬南芥懸浮細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)微管迅速解聚，質(zhì)壁分離后，隨著質(zhì)膜的內(nèi)陷，成束的微管被擠壓發(fā)生彎曲[28]。本研究發(fā)現(xiàn)：滲透脅迫對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用;甘露醇處理?xiàng)l件下，西瓜細(xì)胞微管骨架排列方向混亂，成線狀的微管骨架發(fā)生了解聚，分析其原因可能是滲透脅迫破壞了微管骨架的完整性，抑制了細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)程，從而影響西瓜細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

在滲透脅迫下，植物常常通過自身的防御網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控相關(guān)的代謝途徑——產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以降低或消除滲透脅迫產(chǎn)生的傷害。作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，海藻糖的積累可以提高作物的抗旱、耐鹽堿性[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源海藻糖對(duì)滲透脅迫下西瓜懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制有緩解作用，為進(jìn)一步明確外源海藻糖保護(hù)細(xì)胞生長(zhǎng)提高細(xì)胞抗逆性的分子機(jī)制，本研究在滲透脅迫的基礎(chǔ)上通過外源添加海藻糖測(cè)定細(xì)胞外培養(yǎng)液pH變化、ROS含量、微管骨架結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源海藻糖能夠保護(hù)微管骨架的完整性，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外H+的流向。由于微管骨架、ROS和H+不僅直接參與抗性調(diào)節(jié)，還參與了逆境信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[18-19， 30]，而海藻糖是否可以調(diào)節(jié)這些上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍有待進(jìn)一步研究。

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