孫夢利 王世豪 徐子健 江雪飛 孫化鵬

摘? 要? 為探究外源海藻糖對滲透脅迫下西瓜細胞生長的影響，本研究以西瓜懸浮培養(yǎng)細胞為試材，測定外源海藻糖預(yù)處理后，滲透脅迫對西瓜懸浮培養(yǎng)細胞生長量、細胞外pH、細胞內(nèi)ROS（活性氧簇）相對含量和微管骨架的影響。結(jié)果表明：滲透脅迫下西瓜細胞的生長量明顯受到抑制，并且滲透脅迫可誘導(dǎo)西瓜懸浮培養(yǎng)細胞質(zhì)外體堿化，ROS迸發(fā)，細胞微管骨架發(fā)生解聚;外源添加海藻糖可在一定程度上緩解滲透脅迫對西瓜懸浮細胞生長量的抑制作用，調(diào)節(jié)pH、ROS表達水平、并維持微管骨架結(jié)構(gòu)的完整性。以上研究結(jié)果表明滲透脅迫下，海藻糖對西瓜細胞具有維持細胞生長、保護亞細胞結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)抗性反應(yīng)的功能。

關(guān)鍵詞? 西瓜;滲透脅迫;海藻糖;活性氧;微管骨架

中圖分類號? Q945.78? ? ? 文獻標識碼? A

植物在生長發(fā)育過程中不可避免地遭受多種生物和非生物脅迫的影響，其中干旱、鹽堿、低溫是影響植物生長常見的三大非生物脅迫因素，三者在植物生理上均會導(dǎo)致植物水分匱乏、細胞失水，從而造成滲透脅迫[1]。滲透脅迫下植物體內(nèi)會發(fā)生多種變化，如Lei等[2]發(fā)現(xiàn)滲透脅迫下小麥幼苗的相對水分含量會降低;馬廷臣等[3]利用PEG-6000模擬干旱處理2種水稻幼苗材料，發(fā)現(xiàn)脅迫處理下兩種水稻的根體積、根粗、根長、根系質(zhì)膜相對透性和POD活性等生理指標均受到嚴重影響;另有研究表明，在非生物脅迫條件下，植物體內(nèi)活性氧的生成和消除處于平衡狀態(tài)，但隨著滲透脅迫程度的加深和時間延長，活性氧大量積累，膜脂過氧化加劇，水稻葉片質(zhì)膜透性增加，丙二醛（MDA）含量顯著提升，造成膜系統(tǒng)和多種酶損傷[4]。此外，滲透脅迫還會改變植物的葉綠素結(jié)構(gòu)，使光合色素發(fā)生降解，光合電子系統(tǒng)受到破壞，光合作用受損[5]。

然而植物作為固著型生物，在長期的逆境環(huán)境中往往會形成相應(yīng)的響應(yīng)機制。即植物為適應(yīng)滲透脅迫環(huán)境，細胞常常通過在體內(nèi)積累溶質(zhì)來增強滲透調(diào)節(jié)以降低水勢，維持植物體內(nèi)的水分平衡，從而降低滲透勢，保證作物的正常生長[6]。海藻糖（Trehalose）就是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，近年來有關(guān)海藻糖的研究也比較多。海藻糖是由兩分子葡萄糖殘基以α，α-1，1-糖苷鍵連接而成，具有特殊性質(zhì)的非還原二糖[7]，其廣泛存在于除脊椎動物外的許多生物中，此外，因其穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及特殊的物理性質(zhì)[8]，海藻糖成為了一種重要的抗逆化合物[9-10]，幫助生物細胞在極端條件下維持核酸、蛋白以及生物膜的活性，并保護細胞結(jié)構(gòu)[7]。許多微生物、低等動、植物在遭受不良生活環(huán)境時，細胞內(nèi)通過體內(nèi)調(diào)節(jié)合成海藻糖以抵御逆境脅迫。此外，外源添加海藻糖也能較好保護細胞、生物體及生物大分子。目前已在水稻[11]、小麥[12]、油菜[13]、黑麥草[14]、番茄[15]、海錦葵[16]等植物中得到驗證，主要體現(xiàn)在抗離子滲透、干旱、高溫、低溫脅迫等方面。

外源添加海藻糖對植物的保護作用多體現(xiàn)在植株方面，在細胞水平上，外源海藻糖對滲透脅迫下細胞的保護作用的研究鮮有報道。據(jù)此，本研究以西瓜懸浮細胞系為試驗材料，通過測定和觀察外源海藻糖對滲透脅迫下西瓜懸浮培養(yǎng)細胞的生長量、西瓜細胞外pH、細胞內(nèi)ROS含量、細胞微管骨架結(jié)構(gòu)的變化，初步了解滲透脅迫對西瓜細胞的影響和外源海藻糖對西瓜細胞的保護作用，為后期進一步研究海藻糖對滲透脅迫下西瓜細胞的保護作用機理奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

選用“FR-32-1B-2n”二倍體西瓜的懸浮細胞系為材料，細胞系通過誘導(dǎo)西瓜葉片愈傷組織建立，繼代周期為7 d。

1.2? 方法

1.2.1? 主要試劑配制方法? （1）甘露醇（Mannitol，Sigma-Aldrich， 上海）：用MS培養(yǎng)基（Phytotechnology laboratories，美國）做溶劑，工作濃度為100 mmol/L，121 ℃滅菌30 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）海藻糖（Sigma-Aldrich，上海）：用超純水配制，工作濃度為10 mmol/L，用0.22 μm濾膜過濾滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）Dihydrorhodamine123（DHR123）（Sigma- Aldrich，上海）：用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制，工作濃度10 μmol/L，20 ℃避光保存。

1.2.2? 西瓜懸浮細胞生長量的測定? 分別以100 mmol/L甘露醇、10 mmol/L海藻糖+ 100 mmol/L甘露醇處理西瓜懸浮細胞，設(shè)不加任何處理培養(yǎng)的細胞為對照（CK），處理后細胞置于150 r/min搖床，25 ℃暗培養(yǎng)7 d，參照Ismail等[17]的方法測定△PCV（Packed cell volume），并用以表示西瓜懸浮細胞的生長量，△PCV=沉淀細胞體積（VC）/總細胞體積（VT），其中對照組細胞生長量定為100%。試驗設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3? 西瓜懸浮細胞培養(yǎng)基pH的測定? 吸取2 mL西瓜懸浮細胞于青霉素瓶中，置于150 r/min搖床上平衡穩(wěn)定后，參照Qiao等[18]的方法，使用梅特利-托利多pH計測定不同處理條件下細胞外pH變化，并將對照組的pH計為1，計算處理的相對pH。

1.2.4? 西瓜懸浮細胞ROS的測定? 吸取1.5 mL處于指數(shù)增長期的懸浮細胞于離心管中，置于150 r/min搖床25 ℃下穩(wěn)定培養(yǎng)30 min，然后用MS培養(yǎng)液洗脫后預(yù)平衡1 h，用終濃度10 μmol/L的DHR123染色，染色孵育洗脫后，處理細胞30 min，然后參考Chang等[19]的熒光顯微觀察法，測定不同處理下西瓜懸浮細胞內(nèi)ROS含量的變化。即吸取處理后細胞置于載玻片上，同時進行明場和熒光顯微觀察及拍照，通過計算整個細胞面積的熒光強度與整幅面積的熒光強度的比值，得到ROS相對熒光強度。

1.2.5? 西瓜懸浮細胞微管熒光免疫顯微觀察? 吸取1.5 mL處于指數(shù)增長期的西瓜懸浮細胞于2 mL離心管中，分別用對照組、100 mmol/L甘露醇和10 mmol/L海藻糖（預(yù)處理12 h）+100 mmol/L甘露醇處理細胞1 h。按參考喬飛等[20]的方法，對處理后細胞依次進行固定、酶解、封閉非特異性結(jié)合位點、特異抗體[一抗anti-α-Tubulin DM1A （Sigma-Aldrich）]與抗原的結(jié)合、二抗[FITC- conjugated antibody（Sigma-Aldrich）]與一抗結(jié)合，保濕溫育洗脫，使用Leica SP8激光共聚焦熒光顯微鏡，在40倍物鏡下對其細胞微管骨架進行GFP觀察并拍照。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用WPS Office中的 Excel軟件進行匯總整理，并使用DPS 15.10軟件進行統(tǒng)計分析，經(jīng)Duncan多重比較各處理組間的差異顯著性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 外源海藻糖對滲透脅迫下細胞生長量的影響

植物生長受到抑制是遭受逆境的表觀生理反應(yīng)。由圖1可見，與對照組相比，100 mmol/L甘露醇誘導(dǎo)處理西瓜懸浮細胞7 d后，西瓜懸浮培養(yǎng)細胞的生長量明顯下降，且下降幅度達到57.33%;此外，對照組和甘露醇處理組兩者之間的西瓜細胞生長量差異達到極顯著水平（p< 0.01），說明滲透脅迫能夠抑制細胞的生長;進一步通過外源添加海藻糖預(yù)處理發(fā)現(xiàn)：外源海藻糖處理組西瓜懸浮培養(yǎng)細胞的生長量是甘露醇處理組的1.97倍（p<0.01），說明外源海藻糖對甘露醇脅迫下西瓜懸浮培養(yǎng)細胞的生長量有明顯的緩解作用。

2.2? 外源海藻糖對滲透脅迫下細胞外pH的影響

質(zhì)外體堿化是植物應(yīng)對鹽脅迫的保護機制之一[18]，為探究外源海藻糖在滲透脅迫下對西瓜細胞外pH的影響，本研究通過測定不同處理下西瓜細胞外pH的變化情況，結(jié)果顯示，與對照相不同大寫字母表示處理間差異極顯著（p<0.01），不同小寫字母表示處理間差異顯著（p<0.05）。

比，100 mmol/L甘露醇處理組的細胞外pH整體呈現(xiàn)上升后下降的趨勢，且在其誘導(dǎo)處理20 min左右細胞外pH達到最大值，此后呈現(xiàn)出下降趨勢，但甘露醇處理組細胞外pH依然高于對照組;而加入外源海藻糖預(yù)處理后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西瓜細胞外pH整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，且其誘導(dǎo)處理20～30 min左右時，外源海藻糖對滲透脅迫下西瓜細胞外pH的緩解程度最大（圖2）。說明滲透脅迫可導(dǎo)致西瓜細胞外pH升高，使西瓜細胞發(fā)生細胞外堿化（質(zhì)外體堿化），而海藻糖參與質(zhì)外體堿化的調(diào)節(jié)。

2.3? 外源海藻糖對滲透脅迫下西瓜細胞ROS的影響

滲透脅迫條件下會打破植物體內(nèi)活性氧代謝平衡，為闡明滲透脅迫下外源添加海藻糖對西瓜懸浮細胞內(nèi)ROS的影響，首先，本研究對滲透脅迫下西瓜細胞體內(nèi)ROS的含量變化進行探究，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100 mmol/L甘露醇處理西瓜懸浮細胞30 min后，西瓜懸浮細胞內(nèi)ROS熒光強度以及活性氧相對含量明顯高于對照組，是對照組的1.4倍左右，說明滲透脅迫打破了西瓜細胞體內(nèi)的活性代謝平衡，導(dǎo)致活性氧積累;進一步通過外源添加海藻糖發(fā)現(xiàn)，甘露醇脅迫下經(jīng)外源海藻糖預(yù)處理的西瓜懸浮細胞內(nèi)部ROS熒光強度以及活性氧相對含量明顯降低，說明外源海藻糖能夠緩解滲透脅迫對西瓜細胞的ROS誘導(dǎo)作用（圖3）。

2.4? 外源海藻糖對滲透脅迫下西瓜細胞微管骨架的影響

為了深入了解西瓜細胞微管骨架對滲透脅迫

的應(yīng)答模式，在100 mmol/L甘露醇誘導(dǎo)處理西瓜細胞1 h后，觀察西瓜細胞微管骨架變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對照組西瓜細胞微管骨架呈完整的細平行束排列（圖4A），甘露醇處理組的西瓜細胞微管骨架排列方向混亂，原本呈線狀的微管骨架發(fā)生了明顯的解聚、彌散（圖4B）。為進一步探究外源海藻糖對滲透脅迫下細胞微管骨架的作用，經(jīng)外源海藻糖預(yù)處理12 h甘露醇脅迫1 h后，觀察西瓜細胞的微管骨架，結(jié)果顯示：經(jīng)外源海藻糖預(yù)處理過的西瓜懸浮細胞微管骨架結(jié)構(gòu)與對照組的細胞微管骨架基本相同，呈細平行束排列（圖4C）。說明外源海藻糖對滲透脅迫下西瓜細胞微管骨架有一定的保護作用，能一定程度上緩解滲透脅迫對細胞微管骨架完整性造成的影響。

3? 討論

植物遇到滲透脅迫時會發(fā)生植物組織相對含水量降低[2]、光合作用受損[4]、活性氧代謝系統(tǒng)紊亂[5]以及細胞質(zhì)膜相對透性增大等脅迫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，在甘露醇脅迫處理西瓜懸浮培養(yǎng)細胞一個周期后，西瓜細胞的生長量顯著降低。此外，有研究表明：細胞內(nèi)pH是細胞內(nèi)物理環(huán)境以及控制活體細胞內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)的基本指標和重要因子[21]，逆境脅迫可改變H+流向，引起細胞內(nèi)外pH的變化，而伴隨有細胞質(zhì)酸化的培養(yǎng)基堿化是植物細胞感受外界刺激的早期反應(yīng)[22]，可誘導(dǎo)活性氧的迸發(fā)和次生代謝物質(zhì)合成及一系列防御基因的表達[23]。本研究發(fā)現(xiàn)：在甘露醇誘導(dǎo)處理西瓜懸浮細胞10 min左右時，西瓜懸浮細胞外（培養(yǎng)液）pH開始迅速升高，并在其誘導(dǎo)處理后20 min左右達到最大值;與此同時，在甘露醇脅迫處理西瓜懸浮細胞30 min后細胞內(nèi)ROS熒光強度和相對ROS含量明顯高于對照組，進一步說明滲透脅迫可誘導(dǎo)西瓜懸浮細胞系培養(yǎng)基堿化，ROS迸發(fā)，推測其原因一方面可能是滲透脅迫下，參與植物細胞內(nèi)pH調(diào)控的有關(guān)酶基因NADP-ME（NADP蘋果酸酶），PEPCase（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）被誘導(dǎo)表達[21]，植物細胞中的糖酵解反應(yīng)被促進及大量蘋果酸積累由此而引發(fā)的氫離子（H+）的生產(chǎn)使細胞內(nèi)趨于酸性[24]，另一方面可能是滲透脅迫導(dǎo)致細胞質(zhì)膜受損，存在于細胞膜、液泡膜質(zhì)膜上H-ATPase活性降低，導(dǎo)致質(zhì)子內(nèi)流，細胞質(zhì)酸化，質(zhì)外體堿化，促進ROS迸發(fā)。

微管作為細胞骨架的重要組成部分，在細胞有絲分裂過程中，對紡錘體的形成、染色體的運動、細胞胞質(zhì)分裂和核膜的裂解、重聚有重要作用[25]。正常生長的細胞中，微管骨架的排列方向通常是垂直于細胞的生長軸[26];Komis等[27]研究發(fā)現(xiàn)小麥根尖細胞的微管骨架在高滲脅迫下微管骨架會受到破環(huán);此外，高滲溶液處理擬南芥懸浮細胞時，細胞內(nèi)的細微管迅速解聚，質(zhì)壁分離后，隨著質(zhì)膜的內(nèi)陷，成束的微管被擠壓發(fā)生彎曲[28]。本研究發(fā)現(xiàn)：滲透脅迫對細胞的生長有明顯的抑制作用;甘露醇處理條件下，西瓜細胞微管骨架排列方向混亂，成線狀的微管骨架發(fā)生了解聚，分析其原因可能是滲透脅迫破壞了微管骨架的完整性，抑制了細胞有絲分裂的進程，從而影響西瓜細胞的正常生長。

在滲透脅迫下，植物常常通過自身的防御網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控相關(guān)的代謝途徑——產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以降低或消除滲透脅迫產(chǎn)生的傷害。作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，海藻糖的積累可以提高作物的抗旱、耐鹽堿性[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源海藻糖對滲透脅迫下西瓜懸浮細胞生長的抑制有緩解作用，為進一步明確外源海藻糖保護細胞生長提高細胞抗逆性的分子機制，本研究在滲透脅迫的基礎(chǔ)上通過外源添加海藻糖測定細胞外培養(yǎng)液pH變化、ROS含量、微管骨架結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源海藻糖能夠保護微管骨架的完整性，降低細胞內(nèi)活性氧水平，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外H+的流向。由于微管骨架、ROS和H+不僅直接參與抗性調(diào)節(jié)，還參與了逆境信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[18-19， 30]，而海藻糖是否可以調(diào)節(jié)這些上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍有待進一步研究。

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