劉富康 楊劍寒 曲映紅

摘要[目的]優(yōu)化大青葉粗黃酮的提取工藝，并考察其抗氧化活性。[方法]以70%乙醇溶液浸提干燥的大青葉，用分光光度法測定提取液中的粗黃酮含量。在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優(yōu)化大青葉粗黃酮的提取工藝。測定大青葉粗黃酮對DPPH自由基和羥自由基的清除能力。[結果]大青葉粗黃酮的最佳提取條件為提取時間120 min、提取溫度80 ℃、料液比1∶25（g/mL）。大青葉粗黃酮對于DPPH自由基和羥自由基的清除能力均大于蘆丁，小于VC。[結論]大青葉粗黃酮是一種良好的天然抗氧化劑，值得進一步開發(fā)利用。

關鍵詞大青葉;黃酮;提取工藝;抗氧化性

中圖分類號R284.2文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0150-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.045

大青葉是十字花科植物菘藍（Isatis indigotica Fort.）的干燥葉片。菘藍的根入藥即為人們俗稱的“板藍根”。大青葉味苦，性寒，具有清熱解毒、抗菌抗病毒、增強肌體免疫力等功效[1-2]。有資料顯示，大青葉的黃酮類提取物具有一定的抗氧化作用[3-4]。筆者擬研究大青葉粗黃酮提取物對DPPH自由基和羥自由基的清除能力，以期為開發(fā)綠色安全的天然抗氧化劑提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器大青葉由江西君嶺生物科技公司提供。

試劑：乙醇、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、蘆丁、抗壞血酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、水楊酸等，所用試劑均為分析純。

儀器：AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];LLJ-306Z粉碎機（江門市貝爾斯頓電器有限公司）;KQ5200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;LGJ-10冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;752N分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1粗黃酮含量測定方法。參照王芳等[5]和LONDOO 等[6]的方法，并做些許改動。準確稱取40 mg蘆丁，用70%乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶中。取5個25 mL比色管，分別加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁溶液，各管中加入70%乙醇溶液3.0 mL和5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混合均勻后放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.5 mL，混勻后放置6 min，再加5%氫氧化鈉溶液 4.0 mL，混勻后放置15 min，用80%乙醇定容，以未加蘆丁溶液的1管作為空白對照，在波長510 nm 處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。精確稱取5 g粉碎并烘干的大青葉，70%乙醇超聲浸提，5 000 r/min離心5 min，將上清液旋轉蒸發(fā)去除溶劑后，轉移至100 mL容量瓶中用70%乙醇定容，得到大青葉粗黃酮提取液，按制作標準曲線的方法測定其吸光度，根據(jù)標準曲線方程計算粗黃酮得率。

1.2.2

大青葉粗黃酮提取工藝優(yōu)化。通過單因素試驗分別考察提取溫度（50、60、70、80 ℃）、提取時間（30、60、90、120 min）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL）3個因素對大青葉提取物中粗黃酮得率的影響。

在單因素試驗的基礎上，采用L9（33）正交試驗，以大青葉提取物中粗黃酮的得率為考察指標，對提取溫度、提取時間和料液比3個影響因素進行綜合考察，進一步優(yōu)化大青葉中粗黃酮的提取工藝條件。正交試驗設計如表1所示。

1.2.3

大青葉提取物對DPPH自由基清除率的測定。 按“1.2.2”中正交試驗獲得的最佳提取工藝進行浸提，將離心后的上清液減壓蒸發(fā)除去溶劑后，轉移至100 mL容量瓶中用70%乙醇定容，根據(jù)得到的提取液中黃酮濃度，量取包含10 mg粗黃酮含量的提取液于50 mL容量瓶中，使用70%濃度的乙醇將其定容，以備后續(xù)測定稀釋使用。

將濃度分別為10 、20 、30 、40、50 μg/mL的蘆丁、VC和粗黃酮系列溶液按照勾明玥等[7]和方敏等[8]的方法，測定樣品和空白反應混合物在517 nm處的吸光度，根據(jù)下列公式計算清除率：

K=[1-（A1-A2）/A0 ]×100%

式中，K為樣品溶液對DPPH 自由基的清除率;A1為DPPH溶液加樣品液后的吸光度;A2為樣品液在測定波長的吸光度;A0為DPPH溶液不加樣品液的吸光度。

1.2.4大青葉提取物對羥自由基清除率的測定。參照莫正昌等[9]的方法，測定反應體系在510 nm波長處的吸光度。

清除率計算公式：K=[1-（A1-A2）/A0 ]×100%

式中，K為樣品溶液對羥自由基的清除率;A1為體系中添加樣品液時的吸光度;A2為當向體系中加入1 mL 甲醇代替1 mL H2O2時，測得的樣品對照吸光度;A0為將體系中的樣品溶液改為加入4 mL甲醇時測得的空白對照吸光度（A0）。

2結果與分析

2.1蘆丁標準曲線

經(jīng)線性回歸得到蘆丁濃度與吸光度的關系曲線方程為y=0.019 2+0.054 0x，R2=0.971 4?？梢钥闯?，該方法線性關系良好，該試驗即用此法測定大青葉提取物中粗黃酮的得率。

2.2單因素試驗結果

2.2.1

提取溫度對粗黃酮得率的影響。由圖1可知，粗黃酮的得率隨提取溫度的升高而增大，80 ℃時的得率最大?？赡苁欠肿舆\動隨著溫度的升高而加快，從而使黃酮的溶解度不斷增大;同時高溫導致的細胞膜破損促進了有效成分從組織細胞轉移到提取溶劑中，使有效成分的溶出量增加[10]。

2.2.2提取時間對粗黃酮得率的影響。由圖2可知，當提取時間從30 min開始逐漸增加時，粗黃酮的得率隨著提取時間的增加而上升，90 min時得率達到最高。 隨著提取時間繼續(xù)增加，粗黃酮的得率開始下降。這可能是由于粗黃酮已基本溶出，持續(xù)長時間的高溫可能會破壞已溶出的粗黃酮[11]。

2.2.3料液比對粗黃酮得率的影響。

由圖3可知，隨著溶劑使用量的增加，粗黃酮的得率也隨之升高。當料液比為1∶25時，粗黃酮的得率達到最大。繼續(xù)增加溶劑，費用增加，且粗黃酮得率下降[12]。

2.3正交試驗結果

由單因素試驗得到最好的3個水平分別為提取溫度60、70、80 ℃;提取時間60、90、120 min;料液比1∶15、1∶20、1∶25，按照正交試驗設計表進行正交試驗。由表2可知，最佳的提取工藝為A3B3C3，即提取溫度80 ℃，提取時間120 min，料液比1∶25時大青葉提取物中粗黃酮得率最高。通過極差R分析，三者對粗黃酮得率的影響度為B（提取時間）>C（料液比）> A（提取溫度）。

在最佳的提取工藝條件A3B3C3下進行了3次平行的驗證試驗，結果表明，粗黃酮得率平均值為（3.62±0.01）%，證明正交試驗結果是準確和穩(wěn)定的。

2.4抗氧化性試驗結果

由圖4可知，大青葉粗黃酮對DPPH自由基的清除率隨濃度的升高而上升，在濃度相同的條件下，其清除能力高于蘆丁，低于VC，濃度為20 μg/mL的粗黃酮對DPPH自由基的清除率達70%以上。濃度高于30 μg/mL時，大青葉粗黃酮和蘆丁對DPPH自由基的清除率很接近，均為85%以上。

圖4大青葉粗黃酮、蘆丁和VC對DPPH自由基的清除率

Fig.4The scavenging rate of crude flavonoids，rutin and ascorbic acid to DPPH free radicals

由圖5可以看出，大青葉粗黃酮對羥自由基的清除率隨濃度的提高而上升，在濃度相同的條件下，其清除能力高于蘆丁，低于VC，濃度為40 μg/mL的粗黃酮對羥自由基的清除率達50%以上 。

可以明顯看出，大青葉粗黃酮對DPPH自由基的清除能力高于對羥自由基的清除能力。

3結論

利用正交試驗優(yōu)化大青葉中粗黃酮的提取工藝，最佳的提取條件為提取時間120 min、提取溫度80 ℃、料液比1∶25，該條件下粗黃酮的最大得率為3.62%。

大青葉粗黃酮對DPPH自由基和羥自由基都有一定的清除能力，其清除率介于VC和蘆丁之間，尤其是對于DPPH自由基的清除率較高。大青葉粗黃酮是一種良好的天然抗氧化劑，值得進一步開發(fā)利用。

參考文獻

[1] 陳海紅，孫建宇.大青葉的研究進展[J].中國藥業(yè)，2004，13（8）：79-80.

[2] 李微，陳發(fā)奎，尹相武，等.大青葉的化學成分[J].沈陽藥科大學學報，2005，22（1）：15-16，44.

[3] 高桂花.大青葉黃酮化合物的分離鑒定和含量測定方法研究[D].沈陽：沈陽藥科大學，2008.

[4] 崔旭，李會端.酶輔助法提取大青葉中總黃酮及抗氧化性研究[J].楚雄師范學院學報，2014，29（6）：46-52，79.

[5]王芳，喬璐，淡小艷，等.桑葉黃酮的提取及抗氧化研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2011，38（15）：76-79.

[6] LONDOO J，DE LIMA V R，LARA O，et al.Clean recovery of antioxidant flavonoids from citrus peel：Optimizing an aqueous ultrasoundassisted extraction method[J].Food chemistry，2010，119（1）：81-87.

[7] 勾明玥，劉梁，張春枝.采用DPPH法測定26種植物的抗氧化活性[J].食品與發(fā)酵工業(yè)， 2010，36（3）：148-150.

[8] 方敏，王耀峰，宮智勇.15種水果和33種蔬菜的抗氧化活性研究[J].食品科學，2008，29（10）：97-100.

[9] 莫正昌，鄧靖，汲廣全，等.鹿蹄草提取物體外抗氧化活性評價[J].食品科學，2010，31（3）：19-21.

[10] KONG K W，ISMAIL A R，TAN S T，et al.Response surface optimisation for the extraction of phenolics and flavonoids from a pink guava puree industrial by-product[J].International journal of food science and technology，2010，45（8）：1739-1745.

[11] PENG L X，ZOU L，ZHAO J L，et al.Response surface modeling and optimization of ultrasoundassisted extraction of three flavonoids from tartary buckwheat（Fagopyrum tataricum）[J].Pharmacognosy magazine，2013，9（35）：210-215.

[12] 張海濤，劉祺鳳，田璐陽，等.超聲波輔助提取大青葉中總黃酮及其抗氧化性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2014，53（9）：2124-2126.