戴安娜 胡佳慧 屈玉杏 劉婉洋 許顯玉

摘要[目的]構(gòu)建小鼠ERO1α基因慢病毒過表達(dá)載體，并篩選其在RAW264.7細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。[方法]利用PCR方法擴(kuò)增ERO1α基因的CDS區(qū)并測序;將目的片段亞克隆到慢病毒過表達(dá)載體pCD513B-1上，構(gòu)建pCD513B-ERO1α慢病毒過表達(dá)載體;通過病毒包裝產(chǎn)生慢病毒并轉(zhuǎn)導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞;轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行嘌呤霉素抗性篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞;利用RT-qPCR和Western blot方法檢測ERO1α的表達(dá)效果。[結(jié)果]ERO1α慢病毒過表達(dá)載體構(gòu)建成功，病毒滴度為5×106～10×106 TU/mL;慢病毒成功轉(zhuǎn)導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞并且穩(wěn)定高表達(dá)。[結(jié)論]成功構(gòu)建ERO1α慢病毒過表達(dá)載體，并在RAW264.7細(xì)胞中穩(wěn)定高表達(dá)，為進(jìn)一步研究ERO1α在免疫系統(tǒng)中的功能提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞慢病毒;ERO1α;過表達(dá);RAW264.7細(xì)胞

中圖分類號S-852文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0089-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.026

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶1α（endoplasmic reticulum oxidoreductase 1α，ERO1α）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的重要氧化還原酶，屬于ERO1蛋白家族。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊過程中，ERO1α通過特異性識別蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）對分泌蛋白和膜蛋白二硫鍵形成起到至關(guān)重要的作用[1-3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)ERO1α在多種腫瘤細(xì)胞和癌癥中高表達(dá)，且過表達(dá)ERO1α有利于腫瘤的生長[4]。研究發(fā)現(xiàn)ERO1α通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，激活腫瘤血管生成信號從而促進(jìn)腫瘤的生長[5]。除此之外，ERO1α通過促進(jìn)粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）、趨化因子[chemokine （C-X-C motif） ligand 1/2，CXCL1/2]和主要組織相容性復(fù)合體I（major histocompatibility complex，MHC class I）的表達(dá)，抑制機體的免疫應(yīng)答從而使得腫瘤增強免疫耐受和逃逸[6-7]。雖然ERO1α在機體免疫方面的研究越來越多，但是對于相關(guān)分子機制的研究報道還是很少。筆者通過構(gòu)建ERO1α慢病毒過表達(dá)載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞，以期為進(jìn)一步研究ERO1α的免疫調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要細(xì)胞、載體和細(xì)菌。RAW264.7細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞、慢病毒過表達(dá)載體（穿梭載體）pCD513B-1、慢病毒包裝輔助載體pGag/Pol、pRev和pVSV-G，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)靳亞平教授饋贈;pMD19-T載體，購自大連TaKaRa生物工程有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑。Total RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTARTM HS DNA Polymerase、PrimeScriptTM RT Reagent Kit和TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ等，購自大連TaKaRa生物工程有限公司;DMEM（高糖）培養(yǎng)液、Advanced DMEM培養(yǎng)液、Opti-MEM培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）等，購自美國Invitrogen貿(mào)易有限公司;TurboFect轉(zhuǎn)染試劑，購自加拿大Fermentas公司;ERO1α兔多克隆抗體，購自臺灣Abnova生技股份有限公司;β-actin鼠單克隆抗體，購自天津三箭生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要儀器。Ti-E倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）;Tanon 5200全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）;5810R型冷凍高速離心機（Eppendorf公司）;Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計與合成。根據(jù)NCBI中小鼠ERO1α基因序列（Accession No.AF144695.2），應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計ERO1α基因的特異性引物，用于CDS區(qū)的擴(kuò)增，在引物5′端添加Xba I和BamH I酶切位點，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：上游引物5′-ATTCTAGAATGGGCCGCGCCTGGGG-3′（下劃線為Xba I酶切位點），下游引物5′-TGGGATCCTCAGTGAACATTCTGTAACAAGTGCCTG-3′（下劃線為BamH I酶切位點）。

1.2.2ERO1α基因擴(kuò)增和重組慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建。利用Total RNA提取試劑盒提取RAW264.7細(xì)胞總RNA，分光光度計測定其濃度和純度。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase 擴(kuò)增ERO1α基因的CDS區(qū)，PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性10 s，57 ℃退火5 s，72 ℃延伸1.5 min，共計30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳檢測，利用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收?；厥蘸蟮钠芜M(jìn)行末端加A反應(yīng)并與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜并提取質(zhì)粒，酶切鑒定并送上海生工生物工程有限公司測序。測序正確的片段與線性化的穿梭載體pCD513B-1連接，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)和提取質(zhì)粒，酶切鑒定，并命名為pCD513B-ERO1α。

2.4pCD513B-ERO1α過表達(dá)效果的測定嘌呤霉素篩選后的RAW264.7細(xì)胞提取mRNA和蛋白并進(jìn)行RT-qPCR和Western blot過表達(dá)效果檢測。由圖5A可知，RT-qPCR結(jié)果顯示，未處理Control組和pCD513B-1組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，pCD513B-ERO1α組與Control組和pCD513B-1組相比，ERO1α的mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.001）。由圖5B可知，Western blot結(jié)果顯示，pCD513B-ERO1α組的ERO1α蛋白表達(dá)量顯著高于Control組和pCD513B-1組。

3結(jié)論與討論

ERO1α是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的重要氧化還原酶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊過程中，有助于分泌蛋白和膜蛋白二硫鍵的生成[1-3]。隨著對ERO1α研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)ERO1α對于腫瘤對機體免疫抑制和逃避起著非常重要的作用，且過表達(dá)ERO1α有助于腫瘤的生長以及腫瘤細(xì)胞的增殖[4-7]。為了進(jìn)一步研究ERO1α對機體免疫調(diào)節(jié)的分子機制，成功構(gòu)建了ERO1α重組慢病毒過表達(dá)載體pCD513B-ERO1α，且穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞。

RAW264.7細(xì)胞來源于BALB/c小鼠，是一種永生化的巨噬細(xì)胞系，在研究免疫應(yīng)答反應(yīng)過程中起到非常重要的作用[11]。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞48 h后熒光顯微鏡下能夠觀察到較強的GFP表達(dá)。該試驗采用的是第三代慢病毒載體，即四質(zhì)粒系統(tǒng)，相比于第一代和二代慢病毒載體其生物安全性更高，病毒包裝效率更高。與其他的載體系統(tǒng)相比，慢病毒載體能夠攜帶較長的目的基因片段和穩(wěn)定高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系或原代細(xì)胞，并且不會啟動細(xì)胞的免疫應(yīng)答機制[12]。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后能夠?qū)y帶的ERO1α基因插入到細(xì)胞自身基因組內(nèi)并長期穩(wěn)定表達(dá)，通過嘌呤霉素的篩選作用獲得穩(wěn)定表達(dá)ERO1α的細(xì)胞克隆。細(xì)胞克隆能夠繼續(xù)培養(yǎng)和傳代，并保持對ERO1α的過表達(dá)效果。通過對轉(zhuǎn)導(dǎo)后的RAW264.7細(xì)胞的檢測，發(fā)現(xiàn)pCD513B-ERO1α重組慢病毒過表達(dá)載體能夠顯著增加ERO1α的過表達(dá)效果，證實該載體構(gòu)建成功。

總之，該研究通過擴(kuò)增ERO1α的CDS區(qū)并亞克隆到慢病毒載體pCD513B-1上，成功構(gòu)建了pCD513B-ERO1α慢病毒過表達(dá)載體。通過轉(zhuǎn)導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞并進(jìn)行抗性篩選，成功篩選到穩(wěn)定表達(dá)ERO1α的RAW264.7細(xì)胞，為后續(xù)研究ERO1α的免疫調(diào)節(jié)作用提供了技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1]POLLARD M G，TRAVERS K J，WEISSMAN J S.ERO1p：A novel and ubiquitous protein with an essential role in oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum[J].Molecular cell，1998，1（2）：171-182.

[2] FRAND A R，KAISER C A.ERO1p oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum[J].Molecular cell，1999，4（4）：469-477.

[3] ARAKI K，NAGATA K.Functional in vitro analysis of the ERO1 protein and proteindisulfide isomerase pathway[J].The journal of biological chemistry，2011，286（37）：32705-32712.

[4] KUTOMI G，TAMURA Y，TANAKA T，et al.Human endoplasmic reticulum oxidoreductin 1α is a novel predictor for poor prognosis of breast cancer[J].Cancer Sci，2013，104（8）：1091-1096.

[5] MAY D，ITIN A，GAL O，et al.ERO1L α plays a key role in a HIF1mediated pathway to improve disulfide bond formation and VEGF secretion under hypoxia：Implication for cancer[J].Oncogene，2005，24：1011-1020.

[6] KUKITA K，TAMURA Y，TANAKA T，et al.Cancerassociated oxidase ERO1α regulates the expression of MHC class I molecule via oxidative folding[J].Journal of immunology，2015，194（10）：4988-4996.

[7] TANAKA T，KAJIWARA T，TORIGOE T，et al.Cancerassociated oxidoreductase ERO1-α drives the production of tumorpromoting myeloid-derived suppressor cells via oxidative protein folding[J].Journal of immunology，2015，194（4）：2004-2010.

[8] 陳風(fēng)雷.小鼠Zhangfei基因過表達(dá)和shRNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013：42-43.

[9] CHEN F L，LIN P F，LI X，et al.Construction and expression of lentiviral vectors encoding recombinant mouse CREBZF in NIH 3T3 cells[J].Plasmid，2014，76：24-31.

[10] CHEN F L，LI Q，ZHANG J Y，et al.Silencing effect of lentiviral vectors encoding shRNA of Herp on endoplasmic reticulum stress and inflammatory responses in RAW 264.7 macrophages[J].Genetics and molecular research，2015，14（4）：17587-17598.

[11] RASCHKE W C，BAIRD S，RALPH P，et al.Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus[J].Cell，1978，5（1）：261-267.

[12] BLESCH A.Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer[J].Methods，2004，33（2）：164-172.