葉文斌 何玉鵬 文曉曉 尤旦娃 趙 麗 楊 滟

(1. 隴南師范高等專科學(xué)校，農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣 742500； 2. 隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 成縣 742500； 3. 甘肅省農(nóng)業(yè)固體廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 天水 741000)

0 引 言

鉛是有毒重金屬，也是一種廣泛存在的環(huán)境污染物，污染范圍己由職業(yè)環(huán)境擴(kuò)大到生活環(huán)境，對人體健康造成較大危害[1]，近年來大量研究表明，慢性鉛中毒對神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、肝、腎、脾等全身各系統(tǒng)和器官均有毒性作用，導(dǎo)致如心肌炎、心臟傳導(dǎo)功能障礙、改變心肌細(xì)胞膜通透性等疾病也越來越多[2-3]．鉛對動物及人群毒理作用常表現(xiàn)為減少精液量，降低精子活力和密度，增加畸形率[4]，血清中睪酮黃體生成素、卵泡刺激素和雌二醇水平波動較大，使內(nèi)分泌功能紊亂[5-7]，刺激月經(jīng)周期和經(jīng)期異常，引起不良妊娠和子代生長發(fā)育缺陷[8-9]；鉛還能聚積在細(xì)胞核內(nèi)，干擾細(xì)胞增殖和DNA的合成，影響DNA復(fù)制的精確性而導(dǎo)致染色體丟失[10]．果蠅具有生存期短、繁殖量大、飼養(yǎng)簡便和反應(yīng)靈敏等優(yōu)點(diǎn)，因其代謝系統(tǒng)、生理功能、性別決定和生長發(fā)育等方面同哺乳動物基本相似，故較多地將其應(yīng)用于衰老或壽命等方面的研究[11-12]，同時(shí)果蠅是真核生物，具有與人類相似的生長、發(fā)育、繁殖、衰老等階段．果蠅的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，在藥物和功能食品研究中，果蠅常用作延緩衰老實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，特別是在遺傳生物學(xué)和毒理學(xué)評價(jià)方法中應(yīng)用較多[13]．

動物體內(nèi)鉛的積累會影響其正常生長、發(fā)育、生殖及衰老，甚至?xí)l(fā)生病變和死亡．因此，本文以模式動物黑腹果蠅(drosophilamelanogaste)為研究對象，采用生存實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)分析方法研究不同濃度鉛處理對果蠅的毒理作用，分析探討鉛對果蠅壽命和生育力及抗氧化能力的影響，以期為環(huán)境中重金屬元素鉛對果蠅生長發(fā)育影響的研究提供證據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

恒溫生化培養(yǎng)箱 (寧波東南儀有限公司).高溫滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司).超凈工作臺(山東博客科學(xué)儀器有限公司).電子天平(福州華志科學(xué)有限公司).組織勻漿器(上海壘固儀器有限公司).L5紫外可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司).高速冷凍離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司).電爐(上海圣科儀器設(shè)備有限公司).超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20160822)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒(批號20170509)、MDA試劑盒(批號20170729)均由南京建成生物工程研究所提供．乙醚、乙醇、丙酸、硝酸鉛均為分析純(西安天茂化工有限公司).蔗糖、瓊脂、酵母膏[卡邁舒(上海)生物科技有限].玉米粉(購自隴南成縣五洲超市).

1.2 研究對象

野生型黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)由西北師范大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，培養(yǎng)于溫度為25℃，相對濕度為65%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

基本培養(yǎng)基用250 mL蒸餾水，28 g玉米粉，22 g 蔗糖，2.5 g瓊脂，2 mL丙酸和2.5 g鮮酵母加熱配制[11]．在基本培養(yǎng)基中加入Pb(NO3)2溶液，濃度分別為1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4和1.0×10-5g/mL，設(shè)基本培養(yǎng)基為對照組．

1.3.1生育力測定

在無菌狀態(tài)下，每瓶各接種10對未交配的雄果蠅和處女蠅放入上述培養(yǎng)基中，7 d后移去親本，待出現(xiàn)子一代(F1)果蠅時(shí)，按性別分別統(tǒng)計(jì)數(shù)量和性別比，在觀察記載的同時(shí)，隨機(jī)取出10對未交配的F1代雌、雄果蠅重新放入新培養(yǎng)基中作繼代培養(yǎng)，繁殖子二代(F2)，F(xiàn)2代再繼代培養(yǎng)至子三代(F3)，F(xiàn)3代再繼代培養(yǎng)至子四代(F4)，每處理設(shè)10個重復(fù)，分別統(tǒng)計(jì)其數(shù)量和性別比[11]．

表1 不同濃度Pb2+對果蠅世代生育力統(tǒng)計(jì)只)

注：a與0濃度組相比，t=0.006 5～0.008 1，P<0.01

1.3.2壽命測定

收集未交配的雌、雄果蠅隔離培養(yǎng)，每瓶各接入50只，兩種培養(yǎng)基各接10瓶(5♀，5♂)，每天觀察，記錄死亡個體數(shù)，直到最后一只果蠅死亡[11]．對統(tǒng)計(jì)的結(jié)果進(jìn)行整理，計(jì)算出平均壽命和最高壽命，平均壽命=每組所有果蠅壽命之和÷果蠅總數(shù)；最高壽命=每組最后4只果蠅生存時(shí)間的總和÷4；從生育力實(shí)驗(yàn)中取F2至F4代進(jìn)行壽命實(shí)驗(yàn)，方法同前，以比較其與前者死亡率的差異．

1.3.3果蠅抗氧化活性測定

將培養(yǎng)30 d的果蠅50只，移入含有濕潤濾紙的空白管中，用乙醚使其麻醉、稱重后放入4 ℃預(yù)冷的研缽中，按49 ∶1(μL/mg)的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，充分研磨后，經(jīng)冷凍離心機(jī)3 500 轉(zhuǎn)/min離心15 min，離心半徑3cm，取上清液進(jìn)行抗氧化能力的測定．超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力、丙二醛(MDA)含量及測試液中蛋白質(zhì)含量均采用對應(yīng)試劑盒進(jìn)行測定．所需試劑均嚴(yán)格按照試劑盒說明書配制，測定方法嚴(yán)格遵循試劑說明書的操作進(jìn)行．

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié) 果

2.1 Pb2+對果蠅生育力的影響

不同濃度Pb2+對果蠅世代生育力、世代生育總量和性別比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表1～3．隨著Pb2+濃度的升高，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅數(shù)量均呈現(xiàn)出降低的趨勢．在Pb2+濃度為1×10-5g/mL時(shí)，雌、雄果蠅數(shù)量和果蠅世代總量均低于對照組，與對照組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.006 5，P<0.01)；當(dāng)Pb2+濃度為1×10-2g/mL時(shí)，雌、雄果蠅數(shù)量和果蠅世代總量是對照的50%左右；在Pb2+濃度為1×10-5和1×10-4g/mL時(shí)，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值變化不大，總體接近于1 ∶1；Pb2+濃度為1×10-3g/mL時(shí)，F(xiàn)1至F4代雌、 雄果蠅數(shù)量的比值發(fā)生了明顯的變化，F(xiàn)1至F2代雌、雄果蠅數(shù)量的比值變化不大，總體接近于1 ∶1，F(xiàn)3至F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值為1.116 ∶1和1.143 ∶1；隨著Pb2+濃度升高為1×10-2g/mL時(shí)，F(xiàn)3至F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值為1.316 ∶1 和1.165 ∶1，果蠅世代總量雌、雄果性別比為1.115 ∶1，結(jié)果表明Pb2+對果蠅生育力的影響雄性大于雌性．

表2 不同濃度Pb2+對果蠅世代生育總量統(tǒng)計(jì)只)

注：a與0濃度組相比，t=0.007 1～0.008 9，P<0.01

表3 不同濃度Pb2+對果蠅世代性別比統(tǒng)計(jì)結(jié)果(♀ ∶♂)

表4 不同濃度Pb2+對果蠅不同世代壽命統(tǒng)計(jì)

注：a與0濃度組相比，t=0.006 7～0.008 4，P<0.01；b與0濃度組相比，t=0.038 2～0.045 3，P<0.05

表5 不同濃度Pb2+對果蠅累積世代壽命統(tǒng)計(jì)

注：a與0濃度組相比，t=0.004 9～0.009 0，P<0.01；b與0濃度組相比，t=0.036 7～0.048 4，P<0.05

2.2 Pb2+對果蠅壽命的影響

不同濃度Pb2+對果蠅世代壽命和累積世代壽命的統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表4和表5．隨著Pb2+濃度的升高，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅的壽命均呈出降低的趨勢．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-2g/mL時(shí)，與其他組相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅的壽命，雌、雄果蠅的總壽命和雌、雄果蠅的最長壽命都最低，雌、雄果蠅的壽命分別為(41.92±0.16)和(36.88±0.35)d，對照組的壽命分別為(59.59±0.58)和(58.68±0.51)d；雌、雄果蠅的最長壽命分別為(56.68±0.41)和(57.61±0.25)d，對照組的最長壽命分別為(84.39±0.69)和(83.25±0.75)d．Pb2+濃度在1.0×10-3～1.0×10-5g/mL時(shí)，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅的壽命逐漸升高．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-5g/mL時(shí)，與其他濃度相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅壽命，雌、雄果蠅的總壽命和雌、雄果蠅的最長壽命都最高，但仍低于對照，與對照組相比存在顯著性差異(t=0.008 4，P< 0.01)．

表6 不同濃度Pb2+對果蠅超氧化物歧化酶活性的影響結(jié)果

注：a與0濃度組相比，t=0.005 2～0.009 2，P<0.01；b與0濃度組相比，t=0.034 1～0.047 6，P<0.05

表7 不同濃度Pb2+對果蠅過氧化物酶活性的影響結(jié)果

注：a與0濃度組相比，t=0.006 4～0.008 6，P<0.01；b與0濃度組相比，t=0.046 5～0.048 9，P<0.05

表8 不同濃度Pb2+對果蠅丙二醛含量的影響結(jié)果

注：a與0濃度組相比，t=0.005 6～0.007 7，P<0.01；b與0濃度組相比，t=0.041 7～0.047 3，P<0.05

2.3 Pb2+對果蠅抗氧化酶的影響

不同濃度Pb2+對雌、雄果蠅體內(nèi)SOD、CAT活性和MDA含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表6～8．隨著Pb2+濃度的升高，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性均呈現(xiàn)出降低的趨勢．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-2g/mL時(shí)，與其他濃度相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性都最低，與對照相比存在極顯著差異(t=0.009 2，P<0.01)．當(dāng)Pb2+濃度在1.0×10-5～1.0×10-3g/mL時(shí)F1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)的SOD和CAT活性逐漸升高．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-5g/mL時(shí)，與其他濃度相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)的SOD和CAT活性都最高，但仍極顯著高于對照(t=0.005 2，P<0.01)．隨著Pb2+濃度的升高，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)MDA含量均呈現(xiàn)明顯的升高趨勢，與果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性呈相反趨勢．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-2g/mL時(shí)，與其他濃度相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)MDA含量是最高的，與其他濃度相比存在極顯著的差異(t=0.007 3，P<0.01)．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-5g/mL時(shí)，與其他濃度相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)的MDA含量都是最低的，與對照組相比存在極顯著的差異(t=0.006 8，P<0.01)，這也說明，隨著Pb2+濃度的降低，Pb2+對果蠅的毒害作用在逐漸減弱，果蠅的抗氧化作用也在逐漸增強(qiáng)．在不同Pb2+濃度處理下雌性果蠅體內(nèi)SOD、CAT活性和MDA含量均低于雄性果蠅體內(nèi)的含量，這也說明，雄性果蠅的抗氧化作用強(qiáng)于雄性果蠅．

3 討 論

鉛是一種用途廣泛的重金屬，可經(jīng)呼吸道、消化道等不同途徑進(jìn)入人體并產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性，可影響大腦皮層興奮與抑制的平衡，以及對周圍神經(jīng)產(chǎn)生直接損傷，也會與巰基蛋白結(jié)合并抑制酶的活力和氧化磷酸化，干擾人體的正常代謝，同時(shí)還會損害小動脈和毛細(xì)血管，導(dǎo)致血管痙攣，將明顯增加心血管疾病患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[14-16]．果蠅因?yàn)榫哂猩嫫诙獭⒎敝晨?、反?yīng)靈敏、培養(yǎng)和管理方便，且代謝途徑、生理功能和發(fā)育階段同哺乳動物基本類似等特性常被用作動物模型來研究抗衰老活性及動物抗衰老機(jī)制[17]．本研究以果蠅為研究對象，探討了不同濃度的Pb2+對果蠅生育力和壽命的影響，并以抗氧化酶活性SOD和CAT活以及脂質(zhì)過氧化酶產(chǎn)物MDA含量為指標(biāo)評價(jià)了的抗氧化活性．結(jié)果表明，添加不同Pb2+濃度使F1至F4代雌、雄果蠅世代生育力減弱，壽命降低，當(dāng)Pb2+濃度達(dá)1.0×10-2g/mL時(shí)效果最為明顯，這時(shí)果蠅體內(nèi)MDA含量大量積累，SOD和CAT活性急劇降低，使果蠅提前衰老、死亡并且降低或喪失生殖能力，F(xiàn)3和F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值為1 ∶1.316和1 ∶1.165，果蠅世代總量雌、雄果性別比為1 ∶1.113，這種結(jié)果表明Pb2+對果蠅生育力的影響雄性大于雌性． 而在Pb2+濃度較低時(shí)(1.0×10-5g/mL)F1至F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值變化不大，總體接近于1 ∶1．

果蠅的衰老與體內(nèi)自由基的水平、抗氧化能力及甲基化水平密切相關(guān)，過多的自由基與細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，可破壞DNA及蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生甚至死亡[18]．鉛是一種全身性毒物，機(jī)體不同系統(tǒng)和器官對鉛的毒性效應(yīng)的敏感性不同，血液中鉛質(zhì)量濃度超過100 μg/L 時(shí)，即可人體智力發(fā)育造成嚴(yán)重影響[19]，5×105μg/L鉛水平可導(dǎo)致大鼠海馬細(xì)胞凋亡[20]，Southard等[21]研究發(fā)現(xiàn)，血鉛質(zhì)量濃度>331 μg/L 時(shí)人體發(fā)生腎細(xì)胞癌的危險(xiǎn)性增加．所以當(dāng)重金屬鉛的存在時(shí)，對果蠅體內(nèi)SOD、CAT活力以及MDA含量產(chǎn)生了較為明顯的影響，這種脅迫結(jié)果已經(jīng)表明Pb2+與果蠅的衰老之間存在特定的關(guān)系，MDA是在高濃度Pb2+處理下，果蠅體內(nèi)細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸受自由基作用產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物，當(dāng)與蛋白質(zhì)、肽類等大分子聚合后會引起機(jī)體的衰老[1-3]，從而影響果蠅的壽命．SOD和CAT都具有一定的抗氧化活性，能夠清除生物體內(nèi)自由基并通過減少脂質(zhì)過氧化過程而延緩衰老，當(dāng)Pb2+濃度較高時(shí)，MDA含量急劇升高，SOD和CAT的抗氧化活性降到了最低，可能是，大量積累的MDA刺激果蠅主動啟動SOD和CAT清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基而消耗了兩者的量，來主動增強(qiáng)果蠅的抗性，同時(shí)間接促進(jìn)生育能力．影響果蠅的生育力的因素是多方面的，也是一個非常復(fù)雜的研究課題，而Pb2+是如何在分子水平參與生殖破壞的，還需進(jìn)一步研究與探索．