賈繼陽 徐 奭 申蘭蘭 張耀川 張海嬌 白素蘭**

(1. 首都師范大學生命科學學院，北京 100048； 2. 北京農業(yè)職業(yè)學院園藝系，北京 102442)

0 引 言

等溫滴定量熱技術(ITC)是通過檢測分子相互作用所釋放或吸收的能量，通過單次滴定實驗即可提供完整的熱動力學信息，直接提供結合常數(shù)，化學計量比及反應焓變，揭示蛋白質分子間特異性相互作用[1]．ITC技術的特點是需要的樣品量非常小且無需任何化學修飾或標記，其能夠檢測的親和力范圍從100 μmol/L到1 nmol/L[2]．高質量的ITC數(shù)據(jù)需要經(jīng)過樣品制備，滴定實驗，數(shù)據(jù)分析及實驗優(yōu)化幾個步驟才可能獲得．幾乎所有蛋白質類型的樣品和幾乎所有的緩沖液體系均可用于ITC實驗，但是滴定物的稀釋熱量或對照熱量及滴定物與被滴定物的緩沖液體系是否匹配對ITC實驗的成功與否起到至關重要的作用．當?shù)味ㄎ锉坏味ǖ綐悠烦刂械木彌_液中混勻后，就會產(chǎn)生結合熱之外的其他熱量，稱為稀釋熱量或對照熱量．一個ITC實驗成功的關鍵就是要盡量減小對照熱量，使得結合熱量能夠被測定得更加準確．如果對照熱量非常小且恒定，先用滴定樣品的數(shù)據(jù)扣除平均對照熱量，之后就可以進行曲線擬合以獲得結合參數(shù)．造成對照熱過大有兩個主要原因，一個是滴定物與樣品池中的大分子樣品緩沖液不匹配；另一個是過高的滴定物濃度．最常見的緩沖液不匹配是由滴定物和大分子溶液pH值的差異造成的．對于不匹配的滴定物與被滴定物，樣品制備的關鍵就是通過透析或凝膠過濾進行緩沖液置換，以確保滴定物和被滴定物的溶液完全匹配才能保證稀釋熱完全合格[3]．

擬南芥中控制根毛發(fā)生的關鍵蛋白包括CAPRICE(CPC)和GLABRA3(GL3)，當CPC與GL3互作形成蛋白質復合體時，抑制下游基因GLABRA2(GL2)表達，促進表皮細胞發(fā)育為根毛細胞[4]．雖然已經(jīng)有酵母雙雜交結果證明CPC蛋白和GL3蛋白會發(fā)生相互作用[5]，但是與其它檢測體外蛋白相互作用的實驗方法一樣也存在著假陽性結果的可能．等溫滴定量熱技術靈敏度高，適用范圍廣，測定結果更加精確可靠，目前已被作為測量分子之間相互作用的“黃金標準”[6]．本研究通過大腸桿菌原核表達、分離純化，得到了溶解在咪唑緩沖液中的蛋白質樣品CPC和溶解在還原型谷胱甘肽緩沖液中的蛋白質樣品GL3，在進行ITC滴定之前進行磷酸緩沖液置換使得滴定物與被滴定物緩沖液匹配，獲得了準確的蛋白質相互作用實驗結果．為今后利用等溫滴定量熱儀研究蛋白相互作用提供了理論依據(jù)．

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料及儀器

透析膜(型號 66012，美國賽默飛世爾科技公司)，臺式全溫振蕩器(THZ-C-1，蘇州培英實驗設備有限公司)，多用途高速冷凍離心機(1580R，中國香港基因有限公司)，高速冷凍離心機(CR22G Ⅲ，日本日立集團)，超聲波細胞粉碎機(JY92-2D，寧波新芝生物科技股份有限公司)，紫外/可見光分光光度計(Ultrospec 3100pro，美國GE公司)，馬爾文微量熱等溫滴定量熱儀(MicroCal iTC200，英國馬爾文儀器有限公司)．

1.2 原核蛋白表達和純化

CPC蛋白的表達和純化：將含有CPC-His融合蛋白的大腸桿菌(pET-28a載體BL21感受態(tài)，北京全式金生物技術有限公司)培養(yǎng)在含有50 g/mL 卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中，置于37℃，200 轉/min，搖床中孵育，培養(yǎng)至光密度(OD)值為一定值時，即OD600 nm=0.6～0.8時，加入1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃誘導 5 h．將菌液離心，破碎后與Ni-NTA混合于4℃結合4 h，將混合液倒入重力柱中，先用低濃度50 mmol/L咪唑溶液洗去非特異性結合的蛋白，后用高濃度300 mmol/L 咪唑溶液洗脫并收集目標蛋白．

GL3蛋白的獲取方法：將含有GL3-GST融合蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)在含有50 g/mL 氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，置于37℃，200 轉/min的搖床中培養(yǎng)至OD600 nm=0.6～0.8時，加入1 mmol/L的IPTG，換至16℃誘導10 h．將菌液離心，破碎后與谷胱甘肽瓊脂糖珠子混合于4℃結合4 h，將混合液倒入重力柱中，先用2 mmol/L還原性谷胱甘肽溶液洗去非特異性結合的蛋白，然后用10 mmol/L 還原性谷胱甘肽溶液洗脫并收集目標蛋白．

1.3 蛋白質透析

利用透析袋對兩種不同的蛋白質進行透析來置換成相同濃度的磷酸緩沖液(PBS)體系．將純化得到的CPC-His和GL3-GST分別放于截留分子量為 5 000和20 000的透析袋中，將透析袋分別放于相同濃度的PBS緩沖液(pH 7.4)中，在4℃進行靜置透析10 h．

1.4 蛋白質濃縮

將裝有透析樣品的透析袋放于4℃，把PEG 20 000均勻鋪灑在透析袋上進行蛋白質濃縮．

1.5 等溫滴定實驗

將未透析或透析后的樣品放在等溫滴定量熱儀iTC200的滴定針中，將緩沖液放于樣品池中，溫度設定為25℃．除第1滴溶液的滴定體積為0.4 μL，其余19滴分別為每150 sec滴定2 μL體積．

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 實驗結果

2.1 儀器穩(wěn)定性測量

使用超純水滴定超純水進行儀器性能穩(wěn)定性測試，參考功率設定為 5 μW，儀器穩(wěn)定性結果如圖1所示．基線漂移從5.06～5.11 μW，符合(5.0±0.5)μW的要求．最大幅度為第12滴，約0.05 μW，小于0.05～0.06μW的要求．實驗結果顯示，每一滴水滴清晰，滴定質量好，樣品池清潔，儀器性能好，可以進行后續(xù)實驗．

圖1 水滴水實驗結果

2.2 CPC蛋白質樣品透析優(yōu)化

為了確定樣品溶液對蛋白質相互作用是否有影響，分別對未透析樣品和透析樣品進行滴定過程釋放熱量進行測量．透析樣品前處理過程是將CPC蛋白樣品在PBS緩沖液中進行透析．磁力攪拌雖會增加透析速度減少透析時間，但是也會造成CPC蛋白發(fā)生沉淀．由于ITC技術只適用于檢測液體樣本，沉淀樣本無法利用ITC進行檢測，因此，本研究透析過程采用靜置透析．

用未透析 CPC蛋白溶液滴定PBS緩沖液，滴定過程釋放的熱量值如圖2所示．實驗結果顯示，滴定過程首先發(fā)生的是一個明顯的放熱反應，最大幅度為第2滴，為22.5 μW，遠遠大于0.2 μW稀釋熱的合格標準(對應的積分面積為-335.4 μW.sec)．之后在第8、9滴反應趨于飽和，繼而轉化為一個幅度基本相同的吸熱反應，幅度約為1.25 μW，>0.2 μW稀釋熱的合格標準，直到第20滴(對應的積分面積為14.48 μW.sec)．

圖2 未透析CPC蛋白質樣品滴定反應熱量釋放

未透析CPC蛋白質樣品滴定摩爾ΔH如圖3所示，結果顯示滴定針中的蛋白質樣品和樣品池中的緩沖液發(fā)生了明顯的相互作用，造成過高的對照熱量(稀釋熱)，這是由于滴定針中的蛋白質樣品溶解在咪唑溶液中，與樣品池中的PBS緩沖液不匹配造成的．

圖3 未透析CPC蛋白質樣品滴定摩爾焓變

透析后CPC蛋白質樣品滴定PBS緩沖液，透析后CPC蛋白質樣品滴定反應熱量釋放如圖4所示．最大幅度為第3滴，約0.11 μW；第19滴幅度最小，約為0.05 μW，<0.2 μW稀釋熱的標準，且全部20滴的雙向正負峰一致．

圖4 透析后CPC蛋白質樣品滴定反應熱量釋放

透析后CPC蛋白質樣品滴定摩爾ΔH如圖5所示，結果顯示絕對熱量變化很低．因此，透析樣品能夠提高ITC測定結果的可靠性．

圖5 透析后CPC蛋白質樣品滴定摩爾焓變

2.3 GL3蛋白質透析前后滴定PBS緩沖液

用未透析GL3蛋白質溶液滴定PBS緩沖液，滴定過程釋放的熱量值如圖6所示．實驗結果顯示，滴定過程發(fā)生的是一個明顯的放熱反應，最大幅度為第2滴，為35 μW，遠遠大于0.2 μW稀釋熱的合格標準(對應的積分面積為-539.5 μW.sec)，反應在最后幾滴(18～20)趨于飽和(第20滴對應的峰面積為-10.2μW.sec)．和放熱反應同時存在的是一個較小的吸熱反應，反應最大幅度在第2滴，為1.25 μW，>0.2 μW稀釋熱的合格標準，在第9滴反應趨于飽和．

圖6 未透析GL3蛋白質樣品滴定反應熱量釋放

未透析GL3蛋白質樣品滴定摩爾ΔH如圖7所示，結果均表明滴定針中的蛋白質樣品和樣品池中的緩沖液發(fā)生了明顯的相互作用，造成過高的對照熱量(稀釋熱)，這是由于滴定針中的蛋白質樣品與樣品池中的PBS緩沖液不匹配造成的．

圖7 未透析GL3蛋白質樣品滴定摩爾焓變

然后采用CPC蛋白質透析成功的方法對GL3蛋白質進行透析．不使用磁力攪拌器，使透析緩和，防止過度透析產(chǎn)生沉淀；使靜置時間延長從而延緩整個透析時間．這樣透析后的GL3蛋白質樣品很均一，未發(fā)生沉淀，其滴定PBS緩沖液相關熱量釋放結果如圖8所示．實驗結果顯示，滴定過程發(fā)生的是一個放熱反應，最大幅度第3滴為2.05 μW，>0.2 μW 稀釋熱的合格標準，第20滴幅度最小，為1.0 μW．雖然較未透析的GL3蛋白質稀釋熱有非常明顯的改善，反應最終也未達到飽和，說明透析產(chǎn)生一定的效果，但原始滴定曲線仍體現(xiàn)出滴定針中的蛋白質樣品和樣品池中的緩沖液有一定的相互作用的趨勢，整個反應高于稀釋熱的標準，說明此種適用于類CPC蛋白質透析的方法并不適用于GL3蛋白質．這是由于透析不徹底導致的．

圖8 透析中GL3蛋白質樣品滴定反應熱量釋放

為了獲得可靠的滴定結果，本研究改變了對GL3蛋白質透析方法．在GL3蛋白質透析過程中使用磁力攪拌器進行透析，透析過程中未發(fā)生沉淀現(xiàn)象，獲得了均一穩(wěn)定的GL3蛋白質．透析后GL3蛋白質樣品滴定PBS緩沖液，相關熱量釋放結果如圖9 所示．最大幅度為第二滴，<0.05 μW，接近水滴水，<0.2 μW 稀釋熱的標準．此結果說明透析完全合格，此種透析方式適用于GL3蛋白質．

圖9 透析后GL3蛋白質樣品滴定反應熱量釋放圖

2.4 透析后CPC與GL3蛋白質相互作用測量

使用透析后濃度為68 μmol/L的GL3蛋白質溶液滴定濃度為22 μmol/L的CPC蛋白質溶液．該滴定反應以放熱成分為主，由于釋放熱量僅為微瓦(μW)級別，不會造成蛋白質樣品變性．點對點扣減背景數(shù)據(jù)后，采用順序結合模型進行擬合．當結合位點數(shù)為2時，擬合曲線及結果合理．由熱動力學結果可知，在PBS緩沖液中，透析后的GL3和CPC這兩個蛋白質至少存在兩個結合位點并很可能是以順序結合的方式相互作用．第1個和第2個結合位點的解離平衡常數(shù)Kd分別為(3.2±0.2)和(16.7±0.9)μmol/L，由此可以初步判斷：在第1個結合位點兩個蛋白質相互作用的親和力高于第2個結合位點．由等溫滴定量熱技術所測定出的ΔH及ΔS的絕對數(shù)值不一定準確，但其正負符號是準確的．從ΔH和ΔS的結果來看，二者都是由焓驅動的過程(ΔH<0)，都發(fā)生了不利的熵的補償效應(ΔS<0)．具體來看，第1個和第2個結合位點的ΔH分別為(-160.3±1.1)和(-566.3±18.2) kcal/mol，ΔH<0表明在兩個蛋白質之間可能形成了氫鍵、離子鍵、范德華力等非共價鍵，這些因素都是有利于GL3和CPC這兩個蛋白質結合的．第1個和第2個結合位點的-TΔS分別為152.7和560.5 kcal/mol，其中T為開爾文溫度(T=273.15+反應溫度，此處ITC實驗反應溫度為25℃)．-TΔS>0,由此可知ΔS<0，這表明在兩個蛋白結合過程中，某個蛋白質很有可能還發(fā)生了構像變化，這會使得分子的自由度下降，是不利于GL3和CPC兩個蛋白質結合的因素．由以上測定結果初步判斷GL3和CPC蛋白有兩個結合位點．該結果與已發(fā)表的研究結果相比更加精確，已有研究只是報道CPC蛋白和GL3蛋白間有相互作用，而沒有報道有幾個相互作用位點．

3 討 論

ITC是研究分子間相互作用的一種可靠方法[7]．ITC研究一個經(jīng)典的應用就是在結構信息已經(jīng)明確的情況下，研究體現(xiàn)廣闊生物學功能的蛋白質和配體相互作用的結構和熱動力學之間潛在的關系．這對于理解生物分子相互作用及優(yōu)化配體結合的親和力都非常重要．此外，ITC能夠提供精確的結合熱動力學，因此特別適用于藥物設計，能夠優(yōu)化藥物及靶點的相互作用，促進發(fā)展?jié)撛谛孕滦陀行幬镉糜谖磥砼R床應用．

對于一個完整的等溫滴定量熱實驗，從樣品制備到滴定實驗受很多因素的影響，其中緩沖液體系的匹配就是影響因素之一．ITC實驗要求滴定物與被滴定物的緩沖液體系必須匹配，包括緩沖液的成分，pH值及鹽濃度等．極其微小的pH值，NaCl鹽濃度的差異，會導致極大的背景噪音熱信號，即稀釋熱，從而干擾分子間相互作用的特異性信號．對緩沖液不匹配的兩種蛋白質可以通過透析的方式進行緩沖液置換[8]．

本研究采用擬南芥中兩種不同類型的蛋白質，CPC蛋白和GL3蛋白，進行不同方式的透析，利用ITC分別檢測不同處理的樣品分子的稀釋熱，結果表明對不同類型的蛋白質需要采用不同的透析方法才能達到最佳的效果，最大程度地減少噪音．對于小分子量蛋白宜采用緩慢透析的方法透析防止透析過度，而對于分子量比較大的蛋白宜采用快速透析的方法透析防止透析不徹底．通過ITC初步判斷GL3和CPC蛋白質有兩個相互作用結合位點．已有研究只是報道CPC蛋白和GL3蛋白間有相互作用，而沒有報道有幾個相互作用位點，該結果與已有的研究結果相比更加精確．

ITC是一種可靠的、快速檢測蛋白之間相互作用的技術手段．對應用該技術方法的優(yōu)化為今后檢測蛋白質間相互作用提供了堅實的理論依據(jù)．