程麗娟，劉貴珊，何建國(guó),*，楊曉玉，萬國(guó)玲，張 翀，馬 超

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品無損檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)物理與電子電氣工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

靈武長(zhǎng)棗是寧夏獨(dú)有的鮮食棗品種，富含維生素、礦物質(zhì)[1]。棗果實(shí)具有食療作用，可當(dāng)作補(bǔ)血藥和保健補(bǔ)血?jiǎng)2-3]。糖度是評(píng)價(jià)棗品質(zhì)的首要指標(biāo)和長(zhǎng)棗中重要的風(fēng)味物質(zhì)，影響著棗果實(shí)的成熟度。棗內(nèi)部的糖分主要為蔗糖、果糖和葡萄糖，而果實(shí)中糖累積的最主要形式是蔗糖，在酶的作用下可轉(zhuǎn)化成其他2種糖[4]。糖含量的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有折射儀、糖度計(jì)、蒽酮法等[5-7]，屬于有損檢測(cè)且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。需尋找一種無損且快速測(cè)定果品糖含量的方法，對(duì)于完善長(zhǎng)棗品質(zhì)評(píng)價(jià)有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

高光譜成像技術(shù)可將光譜和圖像相結(jié)合[8]，呈現(xiàn)出無損、快捷靈敏、精確度高等優(yōu)點(diǎn)[9]，是果品品質(zhì)無損檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)果品的研究集中在蟲害檢測(cè)、分類判別、農(nóng)藥殘留、揮發(fā)性成分、內(nèi)部品質(zhì)檢測(cè)等方面[10-14]；Guo Ying等[15]使用4 種建模方法對(duì)棗內(nèi)部物質(zhì)建立預(yù)測(cè)模型，得到最佳模型為最小二乘支持向量機(jī)，表明光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)是一種快速實(shí)用的技術(shù)；Ma Te等[16]利用近紅外光譜對(duì)蘋果中的可溶性固形物含量進(jìn)行檢測(cè)，建立偏最小二乘回歸分析，預(yù)測(cè)值的決定系數(shù)（R2）為0.89，交叉驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of cross-validation，RMSECV）為0.55%；Hu Weihong等[17]用1-MCP處理獼猴桃，使用可見-近紅外系統(tǒng)記錄1-MCP處理組和對(duì)照組的高光譜圖像，建立糖含量的穩(wěn)健模型，果實(shí)中葡萄糖、果糖和蔗糖的最佳預(yù)測(cè)精度分別為0.934、0.867和0.705；Gomes等[18]基于高光譜成像系統(tǒng)測(cè)試2012年和2013年葡萄中的糖含量，對(duì)于2012年采集的樣本，偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的均方根誤差分別為0.94 °Brix和0.96 °Brix，決定系數(shù)（R2）分別為0.93和0.92，2013年樣本均方根誤差值分別為1.34 °Brix和1.35 °Brix，R2分別為0.95和0.92；于慧春等[19]利用光譜成像技術(shù)結(jié)合誤差反向傳播算法神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)檢測(cè)不同波段的枸杞多糖和總糖含量，枸杞總糖含量預(yù)測(cè)正確率達(dá)到100%，相關(guān)系數(shù)為0.996 8； 管曉梅等[20]采集蘋果的高光譜數(shù)據(jù)，引進(jìn)一種優(yōu)化偏最小二乘因子數(shù)的方法，果糖含量預(yù)測(cè)集均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）和相關(guān)系數(shù)（RP）分別由0.657、0.828改善至0.604、0.871；馮迪等[21]利用高光譜成像技術(shù)同時(shí)提取檢測(cè)蘋果糖度與硬度的最佳波長(zhǎng)，結(jié)果顯示，糖度相關(guān)系數(shù)為0.847 6，均方根誤差為3.32；李瑞等[22]采用近紅外光譜儀（900～1 700 nm）測(cè)量藍(lán)莓果實(shí)的硬度和糖度，結(jié)果表明，糖度校正集相關(guān)系數(shù)RC和驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)RP達(dá)到0.891和0.774；劉燕德等[23]研究蘋果中的可溶性固形物和糖酸比，可溶性固形物預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.936，預(yù)測(cè)均方根誤差為0.476 °Brix。以上研究表明利用高光譜技術(shù)檢測(cè)靈武長(zhǎng)棗蔗糖含量理論上具有可行性。

本實(shí)驗(yàn)以靈武長(zhǎng)棗為研究對(duì)象，利用可見-近紅外高光譜采集長(zhǎng)棗圖像并建模分析，優(yōu)選最佳模型，為更深一步探討靈武長(zhǎng)棗的內(nèi)部品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈武長(zhǎng)棗購(gòu)于寧夏靈武果業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司，選取147 個(gè)長(zhǎng)棗樣本4 ℃冷藏。每隔5 d測(cè)試1 次，共計(jì)7 次，每次隨機(jī)取21 個(gè)長(zhǎng)棗作為實(shí)驗(yàn)樣本，將長(zhǎng)棗擦拭干凈，按照編號(hào)依次鋪在平板上，掃描樣本光譜圖像。

蔗糖標(biāo)品 四川省維克奇生物科技有限公司；水系膜（0.45 μm×50 mm）、濾頭（0.45 μm）、乙醇（色譜級(jí)） 天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AGILENT型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有示差檢測(cè)器和Aminex HPX-87H糖分析柱） 美國(guó)安捷倫科技公司；VIS/NIR高光譜成像系統(tǒng)（光譜范圍400～1 000 nm，共包含125 個(gè)波段） 北京卓立漢光儀器有限公司；高光譜成像光譜儀 芬蘭Spectral Imaging公司；CCD攝像機(jī)日本Hamamatsu公司；4 個(gè)150 W的光纖鹵素?zé)?美國(guó)Schott公司；電控位移平臺(tái) 北京Zolix公司。

1.3 方法

1.3.1 高光譜信息采集

高光譜系統(tǒng)預(yù)熱0.5 h后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[24]，由于傳感器內(nèi)部雜質(zhì)與CCD相機(jī)中的芯片會(huì)因熱激發(fā)生成電子，對(duì)圖像來說屬于噪聲，因此需要校正處理[25]，其計(jì)算公式如下：

式中：R為黑白校正后的長(zhǎng)棗光譜；IR為長(zhǎng)棗原始光譜；ID為黑板光譜；IW為白板光譜。

為避免光譜圖像失真，需要對(duì)高光譜成像系統(tǒng)進(jìn)行參數(shù)設(shè)置[26]，最終掃描參數(shù)設(shè)置為：CCD相機(jī)曝光時(shí)間20 ms；物鏡高度385 mm；掃描長(zhǎng)度70 mm；電控位移平臺(tái)速率200 μm/s。

1.3.2 HPLC測(cè)定長(zhǎng)棗蔗糖含量

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg（精確至0.000 1 g），加少量超純水溶解，定容至5 mL容量瓶?jī)?nèi)，制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL溶液。準(zhǔn)確吸取蔗糖溶液2 mL于5 mL容量瓶中定容，制備成蔗糖質(zhì)量濃度為8 mg/mL溶液。同時(shí)按照對(duì)應(yīng)比例稀釋制備蔗糖質(zhì)量濃度均為0.5、1、2、4、8 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

提取液的制備：采集長(zhǎng)棗樣品光譜后，削去果皮，將10 mL無水乙醇加入研磨搗碎后的1 g果肉中先進(jìn)行均質(zhì)，超聲提取0.5 h，11 000 r/min離心15 min后收集上清液，然后將5 mL無水乙醇加入殘?jiān)性俅翁崛　Ｒ陨咸幚淼玫降纳锨逡汉喜ⅲ?5 ℃真空旋干，加入超純水溶解并定容到25 mL容量瓶刻度線位置，充分搖勻，測(cè)試前用0.45 μm針式過濾器過濾。流動(dòng)相為超純水進(jìn)行反復(fù)測(cè)試，最終確定HPLC條件：進(jìn)樣量10 μL，流速0.4 mL/min，等度洗脫，柱溫30 ℃，示差折光檢測(cè)器溫度35 ℃。

1.3.3 光譜數(shù)據(jù)處理

利用ENVI4.8軟件分別從每張長(zhǎng)棗光譜圖像的赤道部位且呈相同暗紅顏色的部位提取30 pixel×30 pixel的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），計(jì)算每張ROI的平均光譜值并作為該長(zhǎng)棗的反射光譜。將光譜值和化學(xué)值建立模型，利用蒙特卡洛交叉驗(yàn)證法檢測(cè)、剔除異常值；光譜理化值共生距離法劃分樣本；在光譜采集過程中，由于存在儀器噪音、暗電流等影響因素，易使光譜曲線產(chǎn)生不重復(fù)和基線漂移等現(xiàn)象[27]，故有必要在模型建立前對(duì)原始光譜進(jìn)行正交信號(hào)校正（orthogonal signal correction，OSC）法、多元散射校正（multiple scattering correction，MSC）、S-G卷積平滑（savitzkygolay，SG）、中值濾波（median-filter，MF）、高值濾波（Gaussian-filter，GF）、基線校準(zhǔn)、去趨勢(shì)7 種預(yù)處理；為減少數(shù)據(jù)量，提高運(yùn)算速度，采用競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)加權(quán)（competitive adaptive reweighted sampling，CARS）算法、連續(xù)投影算法（successive projection algorithm，SPA）和無信息消除變量（uninformative variable elimination，UVE）3 種數(shù)據(jù)降維方法提取特征變量，以期實(shí)現(xiàn)少數(shù)波段代替全波段；將全波段光譜（full spectrum，F(xiàn)S）以及CARS、UVE、SPA、CARS+SPA和CARS+UVE 5 種方法提取的特征波長(zhǎng)分別建立主成分回歸（principle component regression，PCR）、PLSR和多元線性回歸（multivariable linear regression，MLR）模型，對(duì)比分析不同方法對(duì)靈武長(zhǎng)棗蔗糖含量預(yù)測(cè)模型的影響，從而確定最優(yōu)的建模模型。

1.3.4 模型評(píng)價(jià)

由相關(guān)系數(shù)（correlation coefficient，R）、校正集均方根誤差（root mean square error of calibration set，RMSEC）、RMSECV以及預(yù)測(cè)集均方根誤差（root mean square error of prediction set，RMSEP）、RC+RP評(píng)價(jià)模型穩(wěn)定性[28]。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig. 1 Flow chart of data processing

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖像處理

高光譜圖像分析軟件為ENVI 4.8（Research System Inc，USA），原始光譜預(yù)處理以及PLSR、PCR、MLR建模使用The Unscrambler X 10.4軟件，特征波長(zhǎng)提取使用Matlab R2014a軟件，繪圖軟件為Origin。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC結(jié)果

2.1.1 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 蔗糖標(biāo)品（a）與長(zhǎng)棗提取液（b）的HPLLCC圖Fig. 2 HPLC peak of sucrose (a) and jujube (b)

由圖2可知，蔗糖出峰時(shí)間為11.37 min。蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.577 6×10－6x－2.48×10－2（y為蔗糖質(zhì)量濃度，x為峰面積），相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，表明兩者具有良好的線性相關(guān)性。

2.1.2 精密度測(cè)定結(jié)果

由表1可知，樣品的峰面積基本穩(wěn)定，通過計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.27%小于1%，表明該方法精密度高。

表1 精密度結(jié)果Table 1 Precision of the HPLC method

2.1.3 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

由表2可知，加標(biāo)回收率為93.09%～98.47%，平均回收率為95.18%，有較高的準(zhǔn)確性。

表2 加標(biāo)回收率結(jié)果Table 2 Recoveries of spiked samples

2.2 原始光譜數(shù)據(jù)采集結(jié)果

樣本圖像經(jīng)高光譜成像儀采集之后，選擇圖像中的平均光譜信息值作為原始反射光譜，如圖3所示。在675 nm波長(zhǎng)附近，光譜反射值達(dá)到最低，是由于長(zhǎng)棗樣本的C—H伸縮振動(dòng)；900～1 000 nm之間的吸收峰主要由靈武長(zhǎng)棗內(nèi)部水分的吸收引起，該波段為水中O—H基團(tuán)的二倍頻特征吸收峰[29]。

圖3 原始光譜反射曲線Fig. 3 Ref l ectance curves of original spectra

2.3 異常值檢測(cè)與剔除結(jié)果

異常值會(huì)影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度[30]，因此本實(shí)驗(yàn)利用蒙特卡洛方法檢測(cè)異常數(shù)據(jù)，預(yù)處理方法為Mean center；抽樣次數(shù)為2 000，建立147 個(gè)長(zhǎng)棗的PLSR模型，由RMSECV最小確定最佳主成分?jǐn)?shù)。如圖4所示，共檢測(cè)出4 個(gè)異常樣本，分別為：3號(hào)、16號(hào)、123號(hào)、138號(hào)樣本，剔除異常樣本后，相關(guān)系數(shù)RC由0.611增大到0.846，RMSECV由0.023 mg/g減小到0.021 mg/g。

圖4 基于蒙特卡洛方法檢測(cè)異常樣本Fig. 4 Detection of abnormal samples based on Monte Carlo method

2.4 樣本集劃分結(jié)果

采用Galvao等[31]提出的光譜理化值共生距離算法按照3∶1的比例將剔完異常值后的143 個(gè)樣本劃分成105 個(gè)校正集和38 個(gè)預(yù)測(cè)集，結(jié)果見表3，校正集的蔗糖質(zhì)量濃度范圍大于預(yù)測(cè)集質(zhì)量濃度范圍，表明樣本劃分合理。

表3 長(zhǎng)棗蔗糖含量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of sucrose content in jujubes

2.5 光譜預(yù)處理

利用The Unscrambler X10.4軟件對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，由表4可以看出，使用不同預(yù)處理方法，模型的穩(wěn)健性和模型性能均發(fā)生不同程度上的改變，所用預(yù)處理方法建立的PLSR模型中，校正集的相關(guān)系數(shù)RC均在0.8～0.9范圍內(nèi)且基本接近，但是預(yù)測(cè)集的相關(guān)系數(shù)RP差異較大，其中，經(jīng)OSC預(yù)處理之后模型所建立的PLSR預(yù)測(cè)模型參數(shù)最優(yōu)，校正集和原始光譜相差不大，預(yù)測(cè)集有著更高的相關(guān)系數(shù)和更低的均方根誤差，模型相關(guān)系數(shù)RC為0.853、RP為0.794，因此，后續(xù)模型的建立都采用OSC預(yù)處理方法。OSC預(yù)處理方法效果好的原因是利用數(shù)學(xué)上正交的辦法，將原始光譜矩陣X中與待測(cè)品質(zhì)Y不相關(guān)的部分信息濾除，能確保被濾除掉的信息與待測(cè)品質(zhì)無關(guān)[32]。

表4 不同預(yù)處理方法的PLSR模型Table 4 PLSR models with different spectral pretreatments

2.6 光譜數(shù)據(jù)降維結(jié)果

2.6.1 SPA選取特征波長(zhǎng)

SPA[33]是一種消除變量共線性的算法，可以在很大程度上精簡(jiǎn)模型。采用SPA從125 個(gè)波段中選出了5 個(gè)最優(yōu)波長(zhǎng)數(shù)。分別為401、410、425、439、723 nm，特征波長(zhǎng)占總波長(zhǎng)的4%。

2.6.2 UVE提取特征變量

圖5 UVE-PLSR穩(wěn)定性分布曲線Fig. 5 Stability distribution curve of UVE-PLSR model

使用UVE[34]提取長(zhǎng)棗光譜特征波長(zhǎng)，在分組數(shù)定為10的情況下得到RMSECV最小值對(duì)應(yīng)的主成分?jǐn)?shù)為10，圖5為125 個(gè)輸入變量的穩(wěn)定性結(jié)果，兩條水平虛線為變量的選擇閾值（±4.26）。選擇特征波長(zhǎng)時(shí)內(nèi)部信息認(rèn)為是無用信息而被消除，外面的信息為有用信息，相對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)被選擇為特征波長(zhǎng)。用此方法共選取21 個(gè)特征波長(zhǎng)，分別為401、415、607、612、617、622、627、641、646、651、694、795、843、847、895、900、915、919、939、963、972 nm，特征波長(zhǎng)占總波長(zhǎng)的24.8%。

2.6.3 CARS[35]提取特征波長(zhǎng)

圖6 CARS法選取波長(zhǎng)變量過程Fig. 6 Selection of characteristic wavelength variables by CARS method

如圖6所示，設(shè)定運(yùn)行次數(shù)為200。圖6a為篩選特征變量數(shù)的過程，隨著運(yùn)行次數(shù)的加大，變量數(shù)呈現(xiàn)由快到慢的遞減趨勢(shì)，最后下降幅度趨于平緩；由圖6b可知，起初所建模型的RMSECV值不斷減小，說明采樣過程中，無用變量被消除，隨著運(yùn)行次數(shù)的增加，RMSECV值基本穩(wěn)定，表明變量變化不明顯，之后RMSECV隨著采樣次數(shù)的增加而持續(xù)上升，說明一些關(guān)鍵變量數(shù)被消除；圖6c中的每條線代表回歸系數(shù)的變化趨勢(shì)，虛線A1、A2、A3、A4處的RMSECV值增大，是由于變量B1、B2、B3、B4的回歸系數(shù)值降低為0。CARS選出的17 個(gè)特征波長(zhǎng)分別為449、497、511、550、622、684、703、708、775、838、852、862、881、892、939、948、987 nm，特征變量數(shù)縮減為原來的13.6%。

2.7 模型建立結(jié)果

使用PLSR、PCR、MLR建模方法，建立FS和特征波段的模型，見表5。FS-PLSR、FS-PCR和FS-MLR模型對(duì)應(yīng)的RMSECV最小值為0.025、0.027 mg/g和0.029 mg/g，遠(yuǎn)大于3 種特征波長(zhǎng)建模結(jié)果。表明篩選的特征波長(zhǎng)建模預(yù)測(cè)效果較好，原因可能是全波段光譜中包含了大量與長(zhǎng)棗蔗糖含量無關(guān)的信息，降低了建模效果。

3 種單一特征波長(zhǎng)的9 種建模中，校正集和預(yù)測(cè)集結(jié)果非常相近，說明以上3 種提取特征變量的方法是有效的，所建立的模型穩(wěn)定性也好，相比而言，采用CARS提取特征變量后建模結(jié)果優(yōu)于UVE和SPA。對(duì)于CARS+SPA、CARS+UVE特征波長(zhǎng)疊加的模型，雖然提取出的波長(zhǎng)數(shù)減少，但是3 種建模效果都不佳，因此，選取最優(yōu)模型為CARS-PCR，RC、RP為0.861和0.843。RC+RP表示模型穩(wěn)定性，大于其他模型穩(wěn)定性。

表5 不同波長(zhǎng)提取方法建立的PLS和PCR模型的結(jié)果Table 5 Figures of merit of PLS and PCR models based on different wavelength extraction methods

3 結(jié) 論

以147 個(gè)靈武長(zhǎng)棗為研究對(duì)象，利用可見-近紅外高光譜靈武長(zhǎng)棗光譜圖像，提取反射光譜；對(duì)剔除異常樣本后的光譜使用7 種預(yù)處理，采用OSC方法對(duì)光譜預(yù)處理得到模型的效果最好，RC和RP分別為0.853和0.794，說明預(yù)處理方法對(duì)原始光譜進(jìn)行正交信號(hào)校正處理可以降低噪音，獲取更多的有用信息信息，提高建模效果；利用SPA、UVE、CARS、CARS+SPA和CARS+UVE三種方法提取了5、21、17、10、18 個(gè)特征變量，占全波段的4%、24.8%、13.6%、8%、14.4%，對(duì)PLSR、PCR、MLR方法建立的18 種模型對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全波段模型效果差，可能是全波段光譜中包含了大量與長(zhǎng)棗蔗糖含量無關(guān)的光譜信息；OSC-CARS-PCR方法建立的模型效果最好，RC、RP分別為0.861和0.843，RMSEC和RMSEP分別為0.013 mg/g和0.014 mg/g。綜上，利用高光譜圖像技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)棗蔗糖含量的無損檢測(cè)具有可行性，為進(jìn)一步完善長(zhǎng)棗品質(zhì)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。