郭薇丹，劉薇叢，胡作民，李正雯，付湘晉*

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

魚肉富含不飽和脂肪酸，非常容易氧化，產(chǎn)生腥味及有害物質(zhì)，如丙二醛、己醛、壬醛等[1]。添加抗氧化劑是抑制脂肪氧化最常用的方法。隨著人們對(duì)食品品質(zhì)越來越高的追求，亟需開發(fā)高效安全天然抗氧化劑代替化學(xué)合成抗氧化劑，其中食品微生物類抗氧化劑是研究熱點(diǎn)之一[2-3]。大量報(bào)道發(fā)現(xiàn)某些乳酸菌、酵母菌具有優(yōu)良的抗氧化活性[4-6]。Baka等[7]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌Lactobacillus sakei 4413能有效抑制香腸中的脂肪氧化，可使硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值比對(duì)照低1 mg/kg；Zeng Xuefeng等[8]報(bào)道，乳酸菌Lactobacillus plantarum 120、酵母菌Saccharomyces cerevisiae 22可有效抑制酸魚脂肪氧化。付湘晉等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，酵母可有效抑制魚肉脂肪氧化，并清除脂肪氧化產(chǎn)物，如丙二醛、己醛、癸醛，脫除魚肉腥味；所用酵母為面包酵母、葡萄酒酵母、啤酒酵母、釀酒酵母等；這些酵母的最適生長溫度為20～28 ℃，而魚肉一般采用冷藏，限制了酵母菌株在魚肉保鮮上的應(yīng)用。所以，篩選既有抗氧化活性、又有耐冷凍特性的酵母，用于水產(chǎn)品、肉制品保鮮，有一定實(shí)際應(yīng)用前景。

耐冷凍酵母指可以進(jìn)行冷凍保藏，且在冷藏、解凍后，酵母仍然具有較高的活性，發(fā)酵能力和產(chǎn)氣能力都較好的酵母[11]。目前，篩選耐冷凍酵母用于冷凍面團(tuán)加工的研究較多[12-14]，如江正強(qiáng)等[15]在自然界選了上百株酵母菌株，通過冷凍篩選出了耐冷凍酵母W122，在長時(shí)間的冷凍之后，其發(fā)酵力仍然有78%。但目前鮮見報(bào)道篩選既具有抗氧化活性又具有耐冷凍特性的酵母。

本研究以常見食品為分離材料，采用凍融法對(duì)耐冷凍酵母進(jìn)行富集，涂布平板法和平板劃線法分離、純化耐冷凍酵母；并分析這些酵母菌株的生長特性、產(chǎn)氣特性、抗魚肉脂肪氧化特性，為開發(fā)新型水產(chǎn)品、肉制品保鮮劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株分離材料：蘋果、葡萄、榨菜、面肥、豆豉、生啤酒、梔子花、酒糟等購自當(dāng)?shù)厥袌龌蜃灾啤?/p>

培養(yǎng)基：察氏液體培養(yǎng)基，在120 ℃高壓滅菌20 min。取出后冷卻待用。

硫代巴比妥酸（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG25KR離心機(jī) 長沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPK-150BIII微生物培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；BlueStar B紫外-可見分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器股份有限公司；G154DWS立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋廈口致微儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 耐冷凍酵母的富集

取適量面肥、蘋果、葡萄、蘑菇榨菜、豆豉、啤酒、梔子花、酒糟等可發(fā)酵食品，按質(zhì)量比1∶100放入超純水中，將其置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，使其充分發(fā)酵富集酵母菌。之后將所得富集液進(jìn)行凍融循環(huán)。每次－18 ℃冷凍12 h，28 ℃培養(yǎng)24 h，共凍融循環(huán)5 次[16]。凍融結(jié)束后，樣品進(jìn)行純化分離得到所需酵母。

1.3.2 耐冷凍酵母的分離

耐冷凍酵母的篩選采用10 倍稀釋涂布法。將涂布好的培養(yǎng)基放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察已培養(yǎng)好的菌落，典型的酵母菌菌落表面光滑、濕潤、黏調(diào)，質(zhì)地柔軟，易于挑起，多為乳白或奶油色，有酒香味；據(jù)此特征挑取單菌落。對(duì)于所挑取的單菌落平板劃線，進(jìn)行分離、純化。重復(fù)進(jìn)行3 次以上以得到純菌落。將純化后的酵母菌接種至試管斜面上，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 酵母生長曲線的測定

酵母菌株的活化：無菌環(huán)境下，在50 mL錐形瓶中，接種酵母菌1 環(huán)于20 mL培養(yǎng)液，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，得到酵母的種子液。

將所得種子液吸取20 mL分裝于兩個(gè)500 mL三角瓶中（200 mL察氏培養(yǎng)基），于28 ℃培養(yǎng)。接種后每隔2 h取樣，以未接種培養(yǎng)液調(diào)零，測定各樣品在波長600 nm處的吸光度[17]。

1.3.4 酵母發(fā)酵力的測定

取培養(yǎng)18 h的種子液置于具塞試管中，放置杜氏小管，并蓋緊蓋子，以防漏氣。將上述裝有杜氏小管的具塞試管置4 ℃的冰箱中恒溫培養(yǎng)，觀察杜氏小管中產(chǎn)氣情況。

1.3.5 酵母菌株鑒定

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。選用ITS序列，它對(duì)酵母序列有很高的敏感性和特異性[18]。

正向引物ITS1的序列：5’-TCCGTAGGTGAA C C T G C G G-3’；反向引物I T S 4的序列：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR體系（50 μL）：PCR Mix 25 μL，ITS1（10 μmol/L）2 μL，ITS4（10 μmol/L） 2 μL，模板1 μL；去離子水20 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃、10 s，54 ℃、10 s，72 ℃、10 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min。取2 μL PCR擴(kuò)增原液點(diǎn)樣于1%的瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液為TAE緩沖液，控制電壓110 V，電泳40 min。

測序結(jié)果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫BLAST進(jìn)行比對(duì)，得到同源性較高（99%）的基因序列。

1.3.6 酵母抗魚肉脂肪氧化活性測定

手工采集新鮮草魚背部白肉，加1 倍質(zhì)量的蒸餾水，10 000 r/min勻漿1 min，獲得魚漿。取培養(yǎng)18 h的酵母菌液1 mL，加入5 g魚漿，對(duì)照魚肉中加1 mL蒸餾水，充分混勻；樣品4 ℃放置4 h，取樣，根據(jù)文獻(xiàn)方法測定TBARS值[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖像處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、繪圖。采用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的菌落形態(tài)

通過對(duì)分離材料進(jìn)行培養(yǎng)、凍融富集后。對(duì)所得發(fā)酵液進(jìn)行涂布平板法和平板劃線法，分離、純化，從而得到純菌落。最終得到25 株酵母菌落，標(biāo)記為J1～J25。將酵母菌株接種于察氏培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得到純化的酵母單菌落，并觀察其形態(tài)特征。由表1可 知，酵母菌落大部分白色，有個(gè)別為紅色或淺紅色，且形態(tài)為微隆。大部分酵母菌落的邊緣光滑透明，而菌株J4、J9、J14、J21的菌落邊緣則為不透明。所有菌落都是光滑、有光澤且濕潤。

表1 酵母菌落形態(tài)特征Table 1 Colonial characteristics of yeast strains

2.2 酵母的生長特性

圖1 酵母菌株的生長曲線Fig. 1 Growth curves of yeast strains

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌液的吸光度隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而逐漸增大，趨勢明顯，當(dāng)培養(yǎng)至24 h時(shí)，吸光度值趨于平穩(wěn)，酵母菌開始處于穩(wěn)定期。

2.3 酵母的產(chǎn)氣特性

酵母發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生氣體，因此酵母的發(fā)酵能力的強(qiáng)弱可以通過酵母的產(chǎn)氣能力來進(jìn)行判斷。杜氏管發(fā)酵法是一種直觀、簡便測定發(fā)酵力的方法[20]。通過對(duì)篩選所得的25 株耐冷凍菌株進(jìn)行產(chǎn)氣能力的測定，從而進(jìn)一步篩選得到發(fā)酵力好的耐冷凍酵母。由表2可知，低溫條件下，發(fā)酵力較好的菌株有J3、J7、J8、J9、J12、J15、J18、J 25，這幾株酵母4 ℃時(shí)24 h內(nèi)即已產(chǎn)氣，而普通釀酒酵母在12 ℃時(shí)，延遲期約2 d[21]，在4℃時(shí)基本不生長產(chǎn)氣[22]；表明篩選到的菌株在低溫下具有更好活力。

表2 酵母產(chǎn)氣特性Table 2 Gas production characteristics of yeast strains

續(xù)表2

2.4 耐冷凍酵母的鑒定

對(duì)篩選所得的8 株發(fā)酵力較好的酵母進(jìn)行測序鑒定。5.8S rDNA通過引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測序結(jié)果采用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫BLAST進(jìn)行比對(duì)。依據(jù)以上8 株菌株的同源性比較結(jié)果，選取與各菌株同源性較高，且已定名菌株的信息進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖2所示。8 株酵母菌株都屬于異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomal us）。W. anomalus是一種食品中常見酵母[23-24]，如面粉餃子面團(tuán)中，W. anomalus占比67.2%，米粉餃子面團(tuán)中W.anomalus占比27.0%[25]，Khamir酸面團(tuán)中分離到的酵母菌株均鑒定為W. anomalus[26]。

圖2 依據(jù)5.8S rDNA基因序列構(gòu)建8 株酵母的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of 8 yeast strains selected

2.5 耐冷凍酵母抗魚肉脂肪氧化活性

TBARS值表征脂肪氧化二級(jí)產(chǎn)物含 量，特別是丙二醛含量；TBARS值與魚肉腥味強(qiáng)度正相關(guān)。測定發(fā)酵力較好的菌株J3、J7、J8、J9、J12、J15、J18、J25對(duì)冷藏（4 ℃）魚肉T BARS值的影響，結(jié)果見圖3。魚肉冷藏4 h，TBARS值升高約50%；所有菌株均具有一定抗魚肉脂肪氧化活性，其中菌株J15、J25可抑制TBARS值增加，菌株J3、J7、J8、J9、J12、J18可消減TBARS。

圖3 酵母對(duì)冷藏魚肉漿TBARS值的影響Fig. 3 Effect of selected strains on TBARS value of frozen fish mince

Kakuta等[4]比較了2 250 株酵母菌株的抗氧化活性，其中抗氧化活性最高的酵母菌株AN231鑒定為Pichia ohmeri，AN231分泌的抗氧化活性物質(zhì)屬于酚類，具有與BHA、BHT相當(dāng)?shù)目寡趸钚浴Ｒ话憧寡趸瘎┲痪哂幸种浦狙趸爸|(zhì)氧化產(chǎn)物累積的活性，而本研究篩選到的菌株J3、J7、J8、J9、J12、J18可消減TBARS，其抗脂肪 氧化的機(jī)制可能不同于一般抗氧化劑。付湘晉等[9-10]通過分析酵母對(duì)魚肉揮發(fā)性成分的影響，提出酵母醛/醇脫氫酶對(duì)醛類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化是TBARS消減的重要機(jī)制。醛代謝酶，如醛脫氫酶、醛還原酶、醇脫氫酶等是細(xì)胞代謝TBARS的重要途徑[27]。姚仕彬等[28]也發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞能有效降低離體草魚腸道黏膜細(xì)胞培養(yǎng)液中丙二醛濃度，同時(shí)能降低丙二醛導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)溶物漏出，提高丙二醛損傷的細(xì)胞抗氧化能力。因?yàn)門BARS（如丙二醛）可與蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)，破壞人體正常生理功能，引起“羰基應(yīng)激”，與炎癥、衰老、腫瘤、阿爾茨海默病等均密切相關(guān)[29]。所以，消減TBARS的菌株還具有用于功能性食品加工的前景。Konkit等[30]發(fā)現(xiàn)，乳酸菌L. chungangensisCAU28T的醛脫氫酶活性高，用此菌株發(fā)酵的奶酪中醛脫氫酶活性也很高，這種奶酪可顯著降低實(shí)驗(yàn)鼠血清中致癌物質(zhì)乙醛的含量。

3 結(jié) 論

以常見發(fā)酵食品為分離材料，采用凍融5 次對(duì)耐冷凍酵母進(jìn)行富集，通過涂布平板法和平板劃線法分離、純化，獲得25 株酵母菌；通過杜氏管法，篩選到較好的耐冷凍酵母菌株J3、J7、J8、J9、J12、J15、J18、J25，這8 株菌均具有一定抗魚肉脂肪氧化活性，其中菌株菌株J3、J7、J8、J9、J12、J18可消減TBARS；通過5.8S rDNA測序、在線序列比對(duì)及發(fā)育樹分析，8 株酵母菌株均鑒定為W. anomalus。本研究為開發(fā)新型水產(chǎn)品保鮮劑提供了參考，篩選到的菌株具有用于功能性食品加工的前景。