李進(jìn)紅，操麗麗，龐 敏，潘麗軍，侯志剛，水龍龍，鮑 賽，姜紹通*

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

磷脂廣泛存在于植物油脂中，隨著植物油存放時(shí)間的延長，會(huì)使油脂變得不穩(wěn)定，促使氧化酸敗加劇，顏色加深[1]，增加過濾和操作的難度，造成設(shè)備結(jié)焦、脫色脫酸效果不佳、煉耗和輔助劑的用量增大等問題。因此菜籽油的脫磷對精煉工藝變得尤為重要[2-4]。隨著對菜籽油品質(zhì)的要求提高以及節(jié)能環(huán)保的理念增強(qiáng)，酶法脫膠具有廣闊的研究前景[5-6]。磷脂酶主要包括磷脂酶A1、A2、B、C和D，它們能夠特異性水解磷脂內(nèi)部酯鍵，生成對應(yīng)的溶血磷脂和脂肪酸。溶血磷脂具有良好的水分散性，易在水化工藝階段去除[7-8]。磷脂酶A1熱穩(wěn)定性良好，酶活力高，反應(yīng)穩(wěn)定，適合用于科學(xué)研究和工業(yè)應(yīng)用[9]。磷脂酶具有高效性和高度專一性，應(yīng)用于油脂脫膠中具有反應(yīng)條件溫和、耗能低，幾乎不會(huì)產(chǎn)生廢水的優(yōu)點(diǎn)。

固定化酶的方法和材料豐富多樣，隨著綠色發(fā)展的腳步加快，經(jīng)濟(jì)環(huán)保的材料成為科學(xué)研究的熱門話題。水龍龍[10]、劉倩倩[11]等以離子交換樹脂吸附固定化磷脂酶。以大孔樹脂固定化酶會(huì)隨著反應(yīng)次數(shù)的增加，底物和產(chǎn)物的積累，使傳質(zhì)阻力增加，反應(yīng)效率降低。經(jīng)物理吸附的固定化酶結(jié)合穩(wěn)定性差，造成酶較易泄露。陳麗萍[12]、占劍峰[13]等以天然高分子材料包埋固定化磷脂酶。天然高分子材料無毒無害，傳質(zhì)性好，但機(jī)械強(qiáng)度低，易溶解，容易受金屬離子的影響。于殿宇等[14]以纖維素為載體，得到結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好的共價(jià)固定化磷脂酶。

磁性Fe3O4納米離子具有較大的比表面積，同時(shí)具有的超順磁性，即在外加磁場中具有磁性，當(dāng)外加磁場消失時(shí)其磁性也會(huì)消失，因此可以很方便的將固定化酶從反應(yīng)體系中回收重復(fù)利用[15]。雖然磁性Fe3O4納米粒子具有純度高，磁性穩(wěn)定，比表面積大等優(yōu)點(diǎn)，但作為金屬粒子，在溶液中易與氫離子結(jié)合使其表面帶有較強(qiáng)的正電荷，相比其他有機(jī)材料更容易團(tuán)聚，因此對Fe3O4納米粒子表面進(jìn)行改性，成為制備固定化載體重要的一步[16]。用有機(jī)試劑對磁性納米粒子進(jìn)行改性，不僅可以使其表面擁有特定的活性基團(tuán)，同時(shí)還保留了無機(jī)磁性材料的磁響應(yīng)優(yōu)點(diǎn)。楊兆壬[17]、談?wù)丫齕18]等通過高錳酸鉀氧化得到表面羧基化的磁性Fe3O4載體。李曄[19]、阮貴華[20]等以γ-氨丙基三乙氧基硅烷改性得到氨基化的磁性Fe3O4載體。Fe3O4作為無毒無害的環(huán)保材料，在食品加工處理領(lǐng)域具有重要的意義[21-22]。使用Fe3O4磁性納米粒子作為載體進(jìn)行固定化反應(yīng)，能實(shí)現(xiàn)固定化酶與反應(yīng)體系的高效分離，提高酶的重復(fù)使用率，降低生產(chǎn)成本，有利于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)[23]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lecitase? Ultra磷脂酶A1（酶活力5 000 U/mL）丹麥諾維信公司；大豆卵磷脂 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；Fe3O4納米粒子、硅酸乙酯（ethyl silicate，TEOS）、戊二醛（50%） 阿拉丁試劑有限公司；乙醇、氨水、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）、95%乙醇溶液 展望化工試劑有限公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，3-APTES） 上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HitachiS-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Tecnai G2-T20場發(fā)射透射電子顯微鏡 美國FEI公司；Nicolet-8700傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司；MiniFlex-600 X射線衍射儀 日本株式會(huì)社理學(xué)公司。

1.3 方法

1.3.1 載體的制備

Fe3O4-SiO2磁性復(fù)合載體的制備：取2 g Fe3O4納米粒子，加入到含有160 mL乙醇、40 mL水、5 mL氨水的混合液中，超聲處理1 h后，然后將5 mL TEOS緩慢加入到該溶液體系，室溫、350 r/min連續(xù)機(jī)械攪拌反應(yīng)12 h。用去離子水將沉淀洗滌數(shù)次，然后用0.1 mol/L鹽酸處理沉淀12 h，以去除未包裹上SiO2的Fe3O4納米粒子，將沉淀物在室溫下真空干燥24 h。

3-APTES改性的Fe3O4-SiO2磁性復(fù)合載體的制備：在250 mL圓底燒瓶中，加入1 g磁性Fe3O4-SiO2載體，超聲處理1 h，使載體均勻分布在60 mL乙醇中。然后加入6.0 mL NH3·H2O，繼續(xù)超聲10 min，隨后向反應(yīng)液中緩慢加入4.0 mL 3-APTES，在50 ℃持續(xù)攪拌反應(yīng)8 h。反應(yīng)用永久性磁鐵將載體和溶液分離，并分別用乙醇和水充分洗滌至中性。最后，將3-APTES改性的Fe3O4納米顆粒在常溫下真空干燥24 h，獲得含有氨基官能團(tuán)的Fe3O4-SiO2磁性復(fù)合載體[24-25]。

Fe3O4-SiO2磁性復(fù)合載體的交聯(lián)：在50 mL錐形瓶中加入2 g改性后的復(fù)合載體，加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)戊二醛（使用pH 7.0，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋）進(jìn)行交聯(lián)，室溫下，放置在搖床上以轉(zhuǎn)速150 r/min，反應(yīng)12 h。反應(yīng)完成后，用去離子水將載體反復(fù)洗滌，得到交聯(lián)復(fù)合載體[26-27]。

1.3.2 磷脂酶的固定化

稱取交聯(lián)后的Fe3O4-SiO2復(fù)合載體50 mg放入錐形瓶中，加入預(yù)定量0.02 g/mL磷脂酶A1液（一定pH值的磷酸緩沖液稀釋）。在水浴搖床中，于設(shè)定的溫度、150 r/min反應(yīng)預(yù)定的時(shí)間。隨后把固定化好的磷脂酶A1用永久性磁鐵分離，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）反復(fù)洗滌直到上清液中檢測不到游離酶為止，固定化磷脂酶置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹28-29]。

1.3.3 固定化磷脂酶活力的測定

參照文獻(xiàn)[30]方法。將15.0 mL底物溶液于100.0 mL錐形瓶中，將錐形瓶放置50 ℃氣浴搖床上，預(yù)熱8.0 min。加入固定化磷脂酶，在160 r/min、50 ℃條件振蕩下反應(yīng)10.0 min后，立刻加入10.0 mL的95%乙醇溶液終止反應(yīng)。用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)液，采用自動(dòng)電位滴定儀滴定反應(yīng)后的溶液，通過實(shí)驗(yàn)組和空白組計(jì)算NaOH標(biāo)準(zhǔn)液消耗量，測得固定化磷脂酶活力。酶活力回收率和蛋白固載率的計(jì)算見公式（1）和（2）：

式中：A1為固定化酶總活力/（U/mL）；A2為原酶液總活力/（U/mL）。

式中：C1為加入載體中蛋白含量/（mL/mg）；C2為殘液中蛋白含量/（mL/mg）。

1.3.4 固定化載體的表征

場發(fā)射掃描電子顯微鏡采用電子槍為冷場發(fā)射電子源，加速電壓20 kV，分辨率1.4 nm，放大倍數(shù)30～80萬倍；透射電子顯微鏡采用的電子槍為LaB6，加速電壓200 kV，線分辨率0.144 nm，點(diǎn)分辨率0.248 nm，放大倍數(shù)25～110萬 倍；傅里葉紅外光譜儀掃描區(qū)間為4 000～400 cm－1；X射線衍射儀采用的X射線源為Cu靶Kα射線，石墨單色器，管壓力15 kV，管電流30 mA，掃描速率5 °/min，掃描范圍2θ為20°～70°。對樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)、粒徑大小、化學(xué)組分進(jìn)行檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脂酶A1固定化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH值對固定化的影響

在溫度4 0 ℃、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、加酶量4 mL/50 mg、固定化時(shí)間6 h條件下，考察pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）對磷脂酶A1固定化的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH值對磷脂酶A1固定化的影響Fig. 1 Effect of pH on the immobilization of phospholipase A1

由圖1可知，隨著固定化pH值的增加，固定化磷脂酶A1的酶活力回收率和蛋白固載率均先增大后減小。在pH 6.0時(shí)回收率和固載率都達(dá)到最大，當(dāng)pH值繼續(xù)增加時(shí)，回收率和固載率持續(xù)降低。其原因是pH值改變能影響酶的活性部位和載體上相關(guān)官能團(tuán)的解離，在一定的解離程度下，適合酶和載體發(fā)生固定反應(yīng)。另一方面，磷脂酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，當(dāng)pH值過低或過高時(shí)，蛋白質(zhì)的次級鍵和空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而使酶的生物活性喪失，酶活力降低。

2.1.2 固定化溫度對固定化的影響

在固定化pH 6.0、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、加酶量4 mL/50 mg、固定化時(shí)間6 h的條件下，考察固定化溫度（25、30、35、40、45 ℃）對磷脂酶A1固定化的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 固定化溫度對磷脂酶A1固定化的影響Fig. 2 Effect of temperature on the immobilization of phospholipase A1

由圖2可知，隨著固定化溫度的升高，酶活力回收率增大，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，酶活力回收率達(dá)到最高，隨著固定化溫度的繼續(xù)升高，酶活力回收率反而下降。原因是溫度升高使酶分子活化，碰撞次數(shù)增加，酶與載體接觸機(jī)會(huì)上升，從而有利于固定化反應(yīng)，當(dāng)溫度過高時(shí)，使酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化，影響酶活力。溫度對固載率影響不大，在35 ℃時(shí)固載率達(dá)到最大。綜合考慮酶活力回收率和蛋白固載率，最后選擇最適固定化溫度為30 ℃。

2.1.3 固定化時(shí)間對固定化的影響

在固定化pH 6.0、固定化溫度30 ℃、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、加酶量4 mL/50 mg的條件下，考察固定化時(shí)間（4、8、12、16、20 h）對磷脂酶A1固定化的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 固定化時(shí)間對磷脂酶A1固定化的影響Fig. 3 Effect of time on the immobilization of phospholipase A1

由圖3可知，酶活力回收率在初始階段隨著時(shí)間的延長而提高，在8 h時(shí)達(dá)到最高，繼續(xù)延長固定化時(shí)間，酶活力回收率基本保持不變。原因是在初始階段隨著時(shí)間的延長，酶分子不斷固定到載體上，當(dāng)載體上活性基團(tuán)連接的酶分子達(dá)到飽和后，繼續(xù)延長時(shí)間，酶分子與載體也不會(huì)發(fā)生有效的固定化反應(yīng)，酶活力回收率和蛋白固載率基本保持不變。

2.1.4 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化的影響

在固定化pH 6.0、固定化溫度30 ℃、固定化時(shí)間8 h、加酶量4 mL/50 mg的條件下，考察戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2%、4%、6%、8%、10%）對磷脂酶A1固定化的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對磷脂酶A1固定化的影響Fig. 4 Effect of glutaraldehyde concentration on the immobilization of phospholipase A1

戊二醛作為常用的交聯(lián)劑，本身所具有的醛基能與載體上游離的氨基反應(yīng)生成亞胺基團(tuán)（－RC=N－），使載體與載體連接起來，從而增大酶與載體的接觸面積，有利于酶的固定化反應(yīng)。由圖4可知，酶活力回收率隨戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，先升高后降低。在戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于8%時(shí)，磁性載體表面的醛基隨著戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而變多。當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于8%時(shí)，載體表面過度醛基化，使酶與載體交聯(lián)過度，空間位阻變大，酶活力位點(diǎn)受限。戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對蛋白固載率影響較大，隨著戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，載體提供的結(jié)合位點(diǎn)增多，與磷脂酶結(jié)合的機(jī)率增大，更利于酶的固定化，但戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高也會(huì)使酶喪失部分活力。

2.1.5 加酶量對固定化的影響

在固定化pH 6.0、固定化溫度30 ℃、固定化時(shí)間8 h、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的條件下，考察加酶量（2、4、6、8、10 mL/50 mg）對磷脂酶A1固定化的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 加酶量對磷脂酶A1固定化的影響Fig. 5 Effect of enzyme amount on the immobilization of phospholipase A1

由圖5可知，在加酶量較低時(shí)，酶活力回收率隨著加酶量的增加而提高，當(dāng)加酶量達(dá)到8 mL/50 mg載體后，繼續(xù)加大酶量，固定化酶的酶活力回收率反而會(huì)下降。這是由于一定量的載體可以固定的酶量是一定的，當(dāng)載體固定化位點(diǎn)達(dá)到飽和，再繼續(xù)添加酶反而會(huì)使酶分子聚集成團(tuán)，使酶分子之間的活性位點(diǎn)彼此覆蓋，空間位阻增大，對酶活力產(chǎn)生抑制作用。在加酶量達(dá)到8 mL/50 mg后蛋白固定率持續(xù)降低，使酶的利用率下降。在考慮最適加酶量時(shí)應(yīng)考慮蛋白固載率，避免造成不必要的浪費(fèi)，而且降低成本對酶的固定化經(jīng)濟(jì)效益有利。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最佳固定化條件，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Variables and their levels used for response surface design

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2所示，方差分析結(jié)果見表3所示。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression equation

通過Design-Expert 8.0.6分析，可以得到固定化條件與酶活力回收率之間的二次多項(xiàng)式模型為Y=61.34+5.52A+3.83B+6.14C+2.28D－2.02AB－3.50AC+3.91AD－6.08BC－3.64BD－4.06A2－6.21B2－5.53C2－8.97D2。根據(jù)二次多項(xiàng)式，可確定固定化磷脂酶A1的最佳固定化pH 6.67、固定化時(shí)間7.92 h、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.34%、加酶量8.24 mL/50 mg[31]。

由表3回歸模型的方差分析可知，R2=0.966 3，說明該模型能較好地反映固定化磷脂酶A1的酶活力回收率隨固定化條件的變化規(guī)律，模型的P值小于0.000 1，說明此模型極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.238 5大于0.05，說明模型擬合良好，可以接受。校正決定系數(shù)j=0.937 4，表明此方程能夠解釋響應(yīng)值93.74%的變化。AC、AD、BC、BD交互作用對固定化磷脂酶A1的酶活力回收率影響較為顯著，且主次順序?yàn)锽C＞AD＞BD＞AC[32-33]，兩因素交互作用的響應(yīng)面3D圖和等高線圖見圖6。

圖6 各因素交互作用對酶活力回收率影響的響應(yīng)面和等高線Fig. 6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four variables on the recovery of enzymatic activity

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面法獲得的最佳固定化條件，進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的可操作性，最終確定的條件為固定化pH 6.7、固定化時(shí)間7.9 h、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.3%、加酶量8.2 mL/50 mg。在此條件下固定化加酶量2 mL/50 mg的酶活力回收率為63.6%，蛋白固載率為68%， 落在響應(yīng)值Y的95%預(yù)測區(qū)間[56.17%，66.50%]內(nèi)，說明所建立的回歸模型具有較好的擬合性。

2.3 磁性固定化磷脂酶A1的表征分析

2.3.1 掃描電子顯微鏡分析

圖7 樣品掃描電子顯微鏡圖Fig. 7 Scanning electron microscope images of samples

由圖7可知，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子基本形貌為球狀，具有良好的分散性，團(tuán)聚較少，其平均粒徑在15 nm左右。Fe3O4-SiO2磁性復(fù)合載體的粒徑較為均一，表面平滑，呈球狀，各載體間分散性良好，載體的平均粒徑為200 nm左右，比表面積大。復(fù)合載體平均粒徑大于Fe3O4納米顆粒，表明SiO2成功地包裹在Fe3O4粒子表面，包裹后的Fe3O4-SiO2復(fù)合載體表面含有大量的羥基，可通過改性在其表面添加活性基團(tuán)。磁性固定化磷脂酶A1之間交聯(lián)效果良好，同樣具有較好的分散性，有利于固定化酶與底物接觸反應(yīng)[34]。

2.3.2 透射電子顯微鏡分析

圖8 樣品的透射電子顯微鏡圖Fig. 8 Transmission electron microscope image of samples

從圖8可知，F(xiàn)e3O4納米顆粒的分散性較好，極少團(tuán)聚，有利于TEOS均勻地包裹在磁性納米材料表面。磁性固定化磷脂酶A1與Fe3O4納米粒子形態(tài)相似，各固定化載體之間均勻分散，呈核殼形，中間黑色的實(shí)心為Fe3O4納米顆粒，載體周圍呈現(xiàn)出均勻的灰色薄層，可看出SiO2均勻地包裹在Fe3O4納米顆粒表面[35-36]。

2.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

圖9 樣品的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 9 Fourier transform infrared spectraof samples

在圖9b、c中，1 092 cm－1處較強(qiáng)的吸收峰是Si—O—Si鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，表明SiO2成功地包裹在載體表面，1 544 cm－1處較弱的峰是酰胺特征吸收峰，說明磷脂酶成功地固定到磁性載體上。1 631 cm－1處較強(qiáng)的吸收峰表明水分子物理吸附到載體表面，3 421 cm－1處是—OH的伸縮振動(dòng)峰。

2.3.4 X射線衍射分析

在圖10a、b、c中均能觀察到獨(dú)立的窄的尖銳衍射峰，說明各樣品純度高，為較好的“晶態(tài)”物質(zhì)。與X射線衍射標(biāo)準(zhǔn)卡片（PDF 19-0629）對照得出，衍射圖譜上的2θ為30.15°、35.47°、43.10°、53.44°、56.99°、62.51°的衍射角分別很好地對應(yīng)材料中反尖晶石型晶體結(jié)構(gòu)磁性Fe3O4的（220）、（311）、（400）、（422）、（511）、（440）晶面。固定化PLA1的特征衍射峰明顯弱于Fe3O4磁性納米粒子，是因?yàn)楣潭ɑ疨LA1中的Fe3O4相對含量較低[37-38]。

2.4 固定化磷脂酶的酶學(xué)特性分析

2.4.1 最適溫度和pH值

圖11 游離酶和固定化酶的最適溫度和pH值Fig. 11 Optimal temperature and pH for the free and immobilized enzyme

在不同溫度下測定游離酶和固定化酶的酶活力，以酶活力最大的組為100%，其余各組的酶活力與最大酶活力的比值即為相對酶活力。由圖11可知，游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)溫度均為50 ℃，但固定化酶受溫度的影響比游離酶小，在更廣的溫度范圍內(nèi)可以保持相對較高的酶活力?？赡苁且?yàn)楣潭ɑ磻?yīng)使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其對溫度的耐受程度得到提高。游離酶的最適反應(yīng)pH 5.0，固定化酶的最適反應(yīng)pH 6.0。相比游離酶固定化酶的最適pH值變大，pH值穩(wěn)定性更好?？赡苁枪潭ɑ姑傅膸щ娦再|(zhì)改變，或者是固定化載體材料使酶的微觀環(huán)境發(fā)生變化。

2.4.2 操作穩(wěn)定性

圖12 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig. 12 Reusability of the immobilized enzyme

固定化酶在50 ℃與底物反應(yīng)10 min，經(jīng)過10 次反應(yīng)后，固定化酶保留61%的初始酶活力。由圖12可知，在前4 次反應(yīng)中固定化酶活力損失嚴(yán)重，可能是由于與載體結(jié)合不牢固的那一部分磷脂酶，在反應(yīng)過程中從載體上脫落，造成酶活力降低幅度較大。

圖13 固定化酶和游離酶的貯藏穩(wěn)定性Fig. 13 Storage stability of the immobilized and free enzyme

將固定化酶和游離酶貯藏在4 ℃冰箱，每隔5 d定時(shí)測酶活力，如圖13所示。固定化酶和游離酶相對酶活力隨貯藏時(shí)間的延長，在25 d后，固定化酶相對酶活力保持在83%以上，游離酶在79%左右，相對于游離酶，固定化酶的穩(wěn)定性得到了改善。

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)面試驗(yàn)，確定Fe3O4納米粒子固定化磷脂酶A1的最優(yōu)條件：固定化pH 6.7、固定化溫度30 ℃、固定化時(shí)間7.9 h、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.3%、加酶量8.2 mL/50 mg，在此最佳條件下制得磁性固定化磷脂酶A1的酶活力回收率能達(dá)到63.6%，蛋白固載率為68%。

通過表征分析表明磷脂酶被成功固定到了載體表面。固定化載體分散均勻，粒徑均一，平均粒徑在200 nm左右。固定化酶的最適反應(yīng)溫度50 ℃，最適pH 6.0，熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性均高于游離酶，重復(fù)使用固定化酶10 次后，仍保留61%的初始酶活力。

磷脂酶A1具有寬泛的底物專一性，且反應(yīng)徹底速率快，常被應(yīng)用于食物油的脫膠處理。本實(shí)驗(yàn)使用價(jià)格低廉且無毒害作用的Fe3O4納米粒子作為固定化載體，符合當(dāng)下倡導(dǎo)的生態(tài)文明理念。固定化酶的熱穩(wěn)定性好，能與產(chǎn)物迅速分離，便于回收重復(fù)利用。與其他改性方法相比，使用3-APTES和戊二醛改性得到的載體，表面具有大量的活性基團(tuán)，能在較為溫和的條件下與酶更好的接觸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所制得的固定化磷脂酶A1不僅酶活力高，而且穩(wěn)定性好，為食用油酶法脫膠領(lǐng)域的研究和發(fā)展提供參考。