萬 經(jīng)，趙 煒，崔 穎，毛 展，周幗萍*

（1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.南通海關(guān)，江蘇 南通 226006）

蠟樣芽胞桿菌群（Bacillus cereus group）為革蘭氏陽性菌[1-2]，廣泛分布于土壤等環(huán)境中。其中含有12個(gè)同源性很高的種，包括常見的食品污染菌和條件致病菌蠟樣芽胞桿菌（Bacilluscereus，Bc）、昆蟲病原菌蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）、人畜病原菌炭疽芽胞桿菌（Bacillus anthracis，Ba）、具有獨(dú)特真菌樣大而卷發(fā)樣菌落形態(tài)的蕈狀芽胞桿菌（Bacillusmycoides，Bm）和假蕈狀芽胞桿菌（Bacillus pseudomycoides，Bpm）以及韋氏芽胞桿菌（Bacillus weihenstephanensis，Bw）[3]；2010年后又添加了耐高溫具有細(xì)胞毒性的Bacillus cytotoxicus[4]、用于動(dòng)物營養(yǎng)的益生菌Bacillus toyonensis[5]、乳品中分離的耐低溫具有細(xì)胞毒性腐敗菌的維德曼芽胞桿菌（Bacillus wiedmannii）[6]、環(huán)境中分離的兵馬俑芽胞桿菌（Bacillusbingmayongens is）、大山芽胞桿菌（Bacillus gaemokensis）和Bacillus manliponensis6個(gè)新種[7-9]。該群內(nèi)各種在分子水平上基因組同源性極高，其表型和致病性的差別主要由可移動(dòng)遺傳因子—質(zhì)粒所決定，然而質(zhì)?？梢詠G失、消除和結(jié)合轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其種之間分類界定爭議較大[10-11]。蠟樣芽胞桿菌是我國常見的食源性條件致病菌，蘇云金芽胞桿菌在農(nóng)業(yè)上多用于生物農(nóng)藥，炭疽芽胞桿菌是人畜共感染并且具有高致死率，各自具有重要的研究價(jià)值，如何有效區(qū)分它們有重要研究價(jià)值。

蠟樣芽胞桿菌群中12個(gè)種在常規(guī)的16S rRNA序列分析中具有99%～100%相似性，無法進(jìn)行種間區(qū)分[12]。多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法，Bacillus cereus PubMLST數(shù)據(jù)庫選取了glpF、gmk、ilvD、pta、pur、pycA和tpi共7個(gè)常見管家基因片段進(jìn)行測(cè)序，該法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，便于全球不同實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)比對(duì)分析[13]。目前PubMLST數(shù)據(jù)庫中已有50多個(gè)國家2 453條菌株的信息，是蠟樣芽胞桿菌群信息最豐富、準(zhǔn)確的全球數(shù)據(jù)平臺(tái)。

Mega是生成系統(tǒng)進(jìn)化樹較常用的軟件，可用于分析來自物種或種群的DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)[14]；Phyloviz軟件是適合PubMLST數(shù)據(jù)庫配套使用的可結(jié)合序列型和菌株基本信息進(jìn)行多維度聚類分析的軟件[15]；IQ-tree是2014年基于最大似然（maximum likelihood，ML）法推出的建樹軟件，具有準(zhǔn)確、快速、靈活等特點(diǎn)，特別適用于大數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育分析[16-17]。ModelFinder是快速、精確的基于模式選擇法的系統(tǒng)發(fā)育的算法?；谠摯髷?shù)據(jù)平臺(tái)，本研究以Bacillus cereus PubMLST數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)來源，采用常用的分子進(jìn)化遺傳軟件Mega，以及更適合大數(shù)據(jù)分析的Phyloviz和IQ-tree軟件分析探討B(tài)c群內(nèi)不同種之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 軟件

進(jìn)化樹軟件MEGA 6.06、IQ-tree、Phyloviz 1.1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株信息的搜集

Bacillus cereus PubMLST數(shù)據(jù)庫[18]中共有來自于全球50多個(gè)國家蠟樣芽胞桿菌群的2 453條數(shù)據(jù)，從中篩選出具有完整序列信息的蠟樣芽胞桿菌群菌株的信息。目前，Bacillus cereus PubMLST數(shù)據(jù)庫中尚未包含2010年及其之后發(fā)表的6個(gè)新種信息。

1.2.2 鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用MEGA 6.06軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 最小生成樹分析

采用Phyloviz1.1軟件[19-20]對(duì)Bacillus cereus PubMLST數(shù)據(jù)的來源、國別、致病性、序列型（sequence type，ST）[21]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算得出各自在全體數(shù)據(jù)的數(shù)量、總體中的比例，并作出相應(yīng)可視化圖片、表格等。運(yùn)用goeBURST Full最小生成樹（minimum spanning tree，MST）[22]中的距離算法作出蠟樣芽胞桿菌群的MST，通過數(shù)據(jù)組信息中的ST編號(hào)與菌株詳細(xì)信息關(guān)聯(lián)，對(duì)MST中的編號(hào)信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

1.2.4 ML法系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用MAFFT v5[23-24]對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)，基于Linux系統(tǒng)運(yùn)行的IQ-Tree[25]進(jìn)行核酸模型檢測(cè)，以ML法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽胞桿菌群數(shù)據(jù)分析

從Bacillus cereus PubMLST數(shù)據(jù)庫中共篩選出1 329株有效數(shù)據(jù)，7個(gè)管家基因片段拼接后全長為2 829 bp[26]。包括蠟樣芽胞桿菌及其變種共計(jì)864株，占總數(shù)比為65.01%；蘇云金芽胞桿菌及其變種345株，占總數(shù)比為25.96%；炭疽芽胞桿菌共61株，占總數(shù)比為4.59%；韋氏芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌、假蕈狀芽胞桿菌分別為33、21、5株，占總數(shù)比分別為2.48%、1.58%、0.37%。其中，全球五大洲數(shù)據(jù)及未注明地區(qū)數(shù)據(jù)的信息詳見表1。除未明確標(biāo)出地區(qū)的326條數(shù)據(jù)外，亞洲、歐洲和北美洲的蠟樣芽胞桿菌菌群的菌株數(shù)明顯高于南美洲、非洲和大洋洲。

表1 蠟樣芽胞桿菌群在全球的分布Table 1 Global distribution of Bacillus cereus group

去除未明確標(biāo)注分離來源的605株菌株信息，724株菌株的分離來源見圖1。由圖1可知，來源于土壤、奶制品、其他種類食品的菌株居多，也有來自環(huán)境和臨床樣本如病人的肺部組織、肝臟組織以及血液等的菌株。

圖1 蠟樣芽胞桿菌群分離源的分布Fig.1 Distribution of isolation sources of Bacillus cereus group

2.2 蠟樣芽胞桿菌群遺傳分析

2.2.1 蠟樣芽胞桿菌群最小生成樹分析

蠟樣芽胞桿菌群的最小生成樹見圖2。

圖2 蠟樣芽胞桿菌群的最小生成樹Fig.2 Minimum spanning tree of Bacillus cereus group

由圖2可知，蠟樣芽胞桿菌及其變種分布最為廣泛，散布于整個(gè)最小生成樹的各個(gè)分支上；蘇云金芽胞桿菌及其變種多數(shù)集中于左下部一支較大的進(jìn)化分支上，少數(shù)菌株卻分散在其他所有進(jìn)化分支上；而炭疽芽胞桿菌最集中，聚集在左下角進(jìn)化分支的遠(yuǎn)端，與其同在一分支上的近緣菌株有蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌；韋氏芽胞桿菌相對(duì)集中，并與部分蕈狀芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和少量蘇云金芽胞桿菌交織分布在同一進(jìn)化分支上。

蕈狀芽胞桿菌和假蕈狀芽胞桿菌原為同一個(gè)種，具有大而粗糙發(fā)散的卷發(fā)樣菌落，與蠟樣芽胞桿菌群內(nèi)其他種菌株在菌落、表型上差異顯著，后因脂肪酸組成差異而區(qū)分為兩個(gè)不同的種[27]。假蕈狀芽胞桿菌數(shù)量較少，在進(jìn)化樹中分布相對(duì)集中，而蕈狀芽胞桿菌零散地分布在進(jìn)化樹中多個(gè)分支上，與它們較為接近的菌株卻是蠟樣芽胞桿菌；耐低溫、菌落小而光滑的韋氏芽胞桿菌和部分蕈狀芽胞桿菌最為接近。

2.2.2 ML法蠟樣芽胞桿菌群的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

7對(duì)管家基因經(jīng)多基因聯(lián)合后采用ML法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。

圖3 蠟樣芽胞桿菌群7對(duì)管家基因聯(lián)合系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Bacillus cereus group based on 7 pairs of housekeeping genes

由圖3可知，系統(tǒng)進(jìn)化樹的進(jìn)化情況與MST的情況基本一致。炭疽芽胞桿菌、韋氏芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌、假蕈狀芽胞桿菌在進(jìn)化樹中的分布也相對(duì)比較集中，其中，炭疽芽胞桿菌在進(jìn)化樹中的分布主要集中在一個(gè)進(jìn)化分支上。韋氏芽胞桿菌和部分蕈狀芽胞桿菌集中在同一支上，兩者難于區(qū)分。

LIU Y等[28]采用多種生物信息學(xué)方法分析蠟樣芽胞桿菌群遺傳情況發(fā)現(xiàn)，采用pyc基因?qū)eneBank數(shù)據(jù)庫中224個(gè)蠟樣芽胞桿菌菌株的分型效果最好。因此，以Bacillus cereus PubMLST數(shù)據(jù)庫中菌株的pyc基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖4。由圖4可知，pyc基因?qū)ο灅友堪麠U菌群的分型效果與圖3非常接近，可見pyc基因序列分型效果確實(shí)良好。

圖4 蠟樣芽胞桿菌群pyc基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bacillus cereus group based on pyc gene

2.2.3 NJ法蠟樣芽胞桿菌群的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用NJ法構(gòu)建炭疽芽胞桿菌、部分蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌及其變種7對(duì)管家基因聯(lián)合的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖5。

圖5 炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌及其變種7對(duì)管家基因聯(lián)合系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of Bacillus anthracis,Bacillus cereus,Bacillus thuringiensis and its varieties based on 7 housekeeping genes

從圖5可以看出，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中炭疽芽胞桿菌的6個(gè)ST集中在同一個(gè)進(jìn)化分支上，但ST552和ST553則在臨近并相對(duì)獨(dú)立的一個(gè)進(jìn)化分支上，與部分蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌混雜在一起。其中ST552和ST553分離株來源于中國，從牛的血液中分離[29]，但尚未見到關(guān)于這兩個(gè)菌株的具體病理和毒性分析的深入報(bào)道，無法進(jìn)一步判斷這兩株炭疽芽胞桿菌的特性，有研究顯示，除南極洲以外，所有大陸都有地方性炭疽病疫源地[30]。

炭疽芽胞桿菌、部分蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌及其變種的管家基因及部分ST見表2?，F(xiàn)今提交的炭疽芽胞桿菌的ST共有8個(gè)[26]：1、2、3、134、135、552、553、933。其核心型ST1分別與ST3、ST134、ST135和ST933僅有1對(duì)管家基因編號(hào)有差別，ST1與ST3的glp管家基因編號(hào)分別為1和2，兩者有1個(gè)堿基對(duì)差異；ST1與ST134的pta管家基因編號(hào)分別為1和57，兩者有1個(gè)堿基對(duì)差異；ST1與ST135的gmk管家基因編號(hào)分別為1和39，兩者有1個(gè)堿基對(duì)差異；ST1與ST933的glp管家基因編號(hào)分別為1和53，兩者有5個(gè)堿基對(duì)差異。ST1與ST2在ilv和pyc兩個(gè)管家基因編號(hào)存在差異，共有2個(gè)堿基差異。ST552和ST553均與核心型ST1有5個(gè)管家基因編號(hào)不同，且均共有54個(gè)堿基差異。而ST552與ST553兩者之間僅有1個(gè)管家基因編號(hào)不同，兩者有1個(gè)堿基對(duì)差異，但是和其他炭疽芽胞桿菌差別較大。炭疽芽胞桿菌甚至和部分Bc、Bt、Bt變種的更為相似，顯示出炭疽芽胞桿菌在總體上的高度保守性和部分分化，與圖2和圖3分析吻合。

表2 炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌及變種的管家基因及STTable 2 Housekeeping genes and ST of Bacillus anthracis,Bacillus cereus,Bacillus thuringiensis and its varieties

韋氏芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌與假蕈狀芽胞桿菌7對(duì)管家基因聯(lián)合的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖6。由圖6可知，蕈狀芽胞桿菌ST445、ST696、ST970和假蕈狀芽胞桿菌集中在一個(gè)分支上，另兩個(gè)進(jìn)化分支均為蕈狀芽胞桿菌和韋氏芽胞桿菌的混合分布，兩者的進(jìn)化關(guān)系較接近，說明用7對(duì)管家基因聯(lián)合建系統(tǒng)發(fā)育樹的方式是很難將兩者分開的，韋氏芽胞桿菌與蕈狀芽胞桿菌在菌落形態(tài)上差異很大，兩者部分菌株卻有一定的親緣性。

圖6 韋氏芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌及假蕈狀芽胞桿菌7對(duì)管家基因聯(lián)合系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of Bacillus weihenstephanensis,Bacillus mycoides and Bacillus pseudomycoides based on 7 pairs of housekeeping genes

3 結(jié)論

該研究從Bacillus cereus PubMLST數(shù)據(jù)庫中篩選得到1 329株完整的蠟樣芽胞桿菌菌株信息，其中蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）及變種864株、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）及變種345株、炭疽芽胞桿菌（Bacillusanthracis）61株、韋氏芽胞桿菌（Bacillus weihenstephanensis）、蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides）、假蕈狀芽胞桿菌（Bacillus pseudomycoides）分別為33、21和5株。通過Phyloviz Mega和IQ-tree軟件研究蠟樣芽胞桿菌菌群的種群結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞桿菌菌群內(nèi)占比很高的蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌具有豐富而復(fù)雜的遺傳多樣性，相互交織地散布于群內(nèi)幾乎所有的進(jìn)化分支上，兩者無法區(qū)分；炭疽芽胞桿菌在進(jìn)化樹上位于相對(duì)獨(dú)立而保守的一個(gè)分支；韋氏芽胞桿菌與蕈狀芽胞桿菌雖然在菌落形態(tài)上差異很大，但兩者在系統(tǒng)進(jìn)化樹上位于同一個(gè)分支，同源性極高。