張瑞瑞

（湖北工業(yè)大學 馬克思主義學院 湖北省非物質文化遺產(chǎn)研究中心，湖北 武漢 430068）

雜醇油是指除乙醇外含有≥3個碳原子的一元醇的總稱，在白酒中含量較大的為正丙醇、異丁醇和異戊醇[1]。α-酮酸經(jīng)埃里希途徑（Ehrlich）和合成代謝途徑（Harris）形成高級醇[2]。

白酒中過高的雜醇油含量，對人體有毒害作用，造成神經(jīng)系統(tǒng)充血，使人感覺頭痛[3]。雜醇油也是造成白酒苦味、澀味和渾濁的原因。降低白酒中的雜醇油含量，是提升白酒品質的重要措施之一。

國內外降低雜醇油的含量研究主要集中于原料和酒曲的優(yōu)選[4-5]，發(fā)酵工藝的調整[6-9]，白酒酒體的過濾等。采用對酒體的過濾去除白酒中雜醇油的含量，雖有一定效果，但是工藝復雜[10-12]，而且不可避免的會對酒體的口感產(chǎn)生影響?，F(xiàn)在白酒釀造的原料和酒曲都是精選后的原料和酒曲，而且每種白酒的釀造原料和酒曲都有其特定要求，可供選擇的優(yōu)質原料和酒曲的種類有限。在工業(yè)化生產(chǎn)的規(guī)模下，發(fā)酵不同批次或同一批次的不同發(fā)酵槽或發(fā)酵罐都不可避免的存在細微差異，更精細調控發(fā)酵工藝從而降低雜醇油含量的挑戰(zhàn)性較大。

酯化酶能高效酯化醇和酸形成酯。正丙醇的沸點為97℃，乙酸正丙酯的沸點為101.6℃[13]；異戊醇的沸點為131.04℃，乙酸異戊酯的沸點為142.06℃[14]；異丁醇沸點為106.94℃，乙酸異丁酯沸點為116.75℃[15]。酯化酶的酯化具有高效和專一性的特點，利用酯化酶酯化雜醇油成酯，雜醇油被酯化為酯后，沸點升高，分子質量變大。更大的分子質量和更高沸點的酯類物質在蒸餾時，從酒醅蒸餾出進入酒體的量會大大降低?；蚬こ谈脑旒夹g能夠得到酯化特定醇的酯化酶，能夠降低白酒中雜醇油的含量，提升白酒品質；也可以運用于酒頭或酒尾的處理，生產(chǎn)香味酯，將資源合理的利用。雜醇油形成的酯類具有一定果香味，因此，雜醇油酯化酶可以應用于果香味香料的綠色化生產(chǎn)[16]。因此，通過構建高效酯化雜醇油的酯化酶，在酒醅中添加酯化酶高效酯化雜醇油為相對應的酯類，從而大幅度降低白酒中雜醇油的含量是一個新穎可行便捷的措施，形成的雜醇油的酯類還能豐富酒體中酯的種類，增加酒體口感飽滿度。

目前，釀酒酯化酶的報道關注于乙醇為底物的酯化酶[17-18]，例如生產(chǎn)乙酸乙酯、己酸乙酯的酯化酶、乳酸乙酯等酯化酶以及肉桂醇[19]、苯酚等為底物的酯化酶[20]，對釀酒酯化酶的研究主要集中于主要酯類風味物質酯化的酶。檢索PDB數(shù)據(jù)庫和酯化酶的相關文獻，對以雜醇油為底物的酯化酶和雜醇油酯化高活性酶的構建鮮有報道。

本研究采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴增酯化酶基因，易錯聚合酶鏈式反應（error-prone PCR）方法突變酯化酶基因，檢測酶活篩選出高效酯化雜醇油的酯化酶。雜醇油酯化酶的構建不僅對提升白酒的保健品質具有重要的意義，而且對綠色生產(chǎn)具有果香味的酯類具有重要的實際應用意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

產(chǎn)酯化酶近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）：本實驗室從深海沉積物中選育；大腸桿菌（Escherichiacoli）BL21、質粒pET28a（+）：國家典型培養(yǎng)物保藏中心（national type culture collection，NTCC）-BioVector質粒載體菌株細胞基因保藏中心。

1.1.2 化學試劑

乙酸正戊酯、乙酸正丙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯及乙醇（均為色譜純）：阿拉丁控股集團有限公司；分子試劑盒：天根生化科技有限公司；EcoR I限制性內切酶（10 U/mL）、Xho I限制性內切酶（10 U/mL）：寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。D2500-01瓊脂糖凝膠回收試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，調pH至7.0，用去離子水定容至1 L。在121℃條件下滅菌15 min。固體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1214B超凈工作臺：上海智城分析儀器有限公司；FE20型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；AR1140電子分析天平：奧克斯國際貿(mào)易有限公司；PHX智能生化恒溫培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰?；C100 PCR儀、PowerPac電泳儀：美國Bio-Rad公司；7890A氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：美國安捷倫公司；程序控制超聲波細胞粉碎機HN-1000CS：上海汗諾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆

克隆Candida parapsilosis的酯化酶，編碼基因的堿基長度均為1 398 bp，用RT-PCR方法克隆[21]。引物序列：lip1F-1（5"→3"）：CCGGAATTCATGCATTTTTGGTT CCTATCCA；lip1R-1（5"→3"）：TTGAATCTCATACATTTTCACATT CTCGAGCGG。下劃線部分為酶切位點。

1.3.2 質粒構建

將反轉錄獲取的PCR產(chǎn)物脂肪酶（lipase）及提取的空載質粒pET28a（+）分別進行雙酶切，再以T4 DNA連接酶于16℃條件下連接過夜。重組質粒以化學轉化法導入Escherichia coli DH5α，涂布卡那霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)得到含目的基因的亞克隆菌株。單菌落進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增產(chǎn)物測序，驗證構建的質粒序列。

1.3.3 易錯PCR

根據(jù)已知的基因序列，利用引物設計軟件Primer 5.0設計一對特異引物，引物序列：E-lip1F（5"→3"）：GGAATTC ATGCACTTTTGGTTCT；E-lip1R（5"→3"）：ATGCAGTTCCAAATTCTCGAGCGG。

使用含有初始酯化酶的質粒作為易錯PCR的模板。以即用型易錯PCR試劑盒進行易錯PCR。獲得的目的條帶以膠回收試劑盒回收，儲存于-20℃?zhèn)溆?。易錯PCR的PCR程序：94℃變性3min；94℃變性30s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，退火溫度每個循環(huán)下降0.5℃，循環(huán)11次。然后94℃變性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)19次。

利用瓊脂糖膠回收試劑盒回收純化擴增產(chǎn)物，回收純化的易錯PCR酯化酶產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.4 轉化和篩選

回收的易錯PCR產(chǎn)物及空載質粒pET28a（+）分別進行EcoR I限制性內切酶和Xho I限制性內切酶雙酶切，酶切結束后純化，進行T4 DNA酶連接。獲得的突變重組質粒以電轉化法導入Escherichia coli BL21，轉化后涂布卡那抗性LB平板，挑選單菌落。將挑取出的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6h，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG）誘導培養(yǎng)20 h后進行酶活檢測，檢測酯化雜醇油的酶活，活性高的為篩選的轉化子。

1.3.5 測序

提取酶活提高的轉化子的質粒，以pET28a（+）通用測序引物進行PCR產(chǎn)物擴增。產(chǎn)物進行測序，以DNAMAN軟件進行序列的比對及翻譯，得到突變的編碼序列及氨基酸序列。

1.3.6 誘導表達和酯化酶酶液制備

挑取出的大腸桿菌（Escherichia coli）單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6 h，加入IPTG誘導培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)的菌液用超聲波細胞粉碎機120 W條件下超聲3 s，停10 s，超聲破碎2.0 min。破碎的菌液5 000 r/min離心10 min，上清液為酯化酶酶液，進行3種醇的混合酯化以檢測酶活。

1.3.7 分析檢測

酯化酶酶活測定的酯化體系為：雜醇油含量（正丙醇、異丁醇、異戊醇）各1%；乙酸2%；酯化酶酶液50%；蒸餾水46%。先加水、雜醇油及乙酸，再加入酶液。且在加入粗酶液前，以200 g/L的NaOH溶液將體系pH調至3.5。粗酶液均做2組酯化體系，其中1組為試驗組，1組為對照組。對照組為將酶液以等量的未誘導菌株酶液代替。酯化體系配制完畢后，放置于30℃、200 r/min恒溫搖床中酯化1 d。酯化酶的定義為：24 h酯化合成1.0 mg/L酯所需的酶量為一個酶活單位（U/L）。

采用氣相色譜法測定酯化產(chǎn)物中酯含量[22-23]。以出峰時間定性，以峰面積定量。

2 結果與分析

2.1 Candida parapsilosis酯化酶基因擴增

重組質粒構建成功后，亞克隆于DH5α菌株中，以pET28a（+）質粒測序通用引物進行菌落原位PCR擴增，電泳檢測后測序，結果見圖1。由圖1可知，菌落原位PCR擴增出的堿基大小約為1 400 bp，與預期大小一致。產(chǎn)物測序結果與設計的序列一致。

圖1 酯化酶大腸桿菌BL21原位菌落PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of in situ PCR amplification product of Escherichia coli BL21

2.2 雜醇油酯化酶易錯PCR

易錯PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖2a。由圖2a可知，通過梯度降度PCR（touch down-PCR，TD-PCR）程序，該易錯PCR的特異性極好，且目的條帶的大小與預期的一致。易錯PCR產(chǎn)物膠回收純化，純化的易錯PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖2b。由圖2b可知，純化后彌散帶消失。單一的目的條帶有利于高效酶切和高效與酶切的質粒連接。

圖2 易錯PCR擴增產(chǎn)物(a)、易錯PCR產(chǎn)物切膠純化片段及收獲片段(b)電泳圖Fig.2 Electrophoresis of error-prone PCR amplification products(a)and purified and harvested fragment of error-prone PCR product by cutting gel(b)

2.3 篩選轉化子產(chǎn)生的酯化酶的酯化性能

以空載質粒E.coli BL21酶液為空白對照，Candida parapsilosis酯化酶作為初始酯化酶。初始酯化酶在大腸桿菌（Escherichiacoli）BL21表達得的酯化酶活性為：乙酸正丙酯10.828U/L；乙酸異丁酯2.579 U/L；乙酸異戊酯3.82 U/L。

初始酯化酶經(jīng)過多次易錯PCR，以及PCR產(chǎn)物酶切，連接質粒，轉化篩選，獲得1株雜醇油酯化能力顯著突變菌株L1-70，其酯化酶催化活性測定結果見表1。由表1可知，菌株L1-70對正丙醇、異丁醇及異戊醇均有酯化作用，酯化酶酶活分別是初始酯化酶酶活的2.28倍、2.42倍及2.29倍。已有報道的酯化酶的研究主要為以乙醇為底物的酶[17-19]，構建的雜醇油酯化酶能高效酯化非乙醇的高級醇。酯化酶對雜醇油酯化能力的提高主要原因是氨基酸序列的改變導致的酯化酶三維結構的改變[24]，三維結構的改變可能導致了結合部位或催化部位的改變，從而更有利于雜醇油、乙酸和酶形成復合物，進而形成乙酸正丙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯。

表1 初始酯化酶與構建酯化酶的酶活對比Table 1 Comparison of the original esterase and the constructed esterase activities

2.4 高活性雜醇油酯化酶的氨基酸序列

對正向突變菌株L1-70測序，再以分析軟件進行比對，結果見圖3。由圖3可知，L1-70突變的堿基為3個，突變的氨基酸也為3個，分別為V146D：146位纈氨酸突變?yōu)樘於彼?；T198I：198位蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?；E376K：376位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?。酶的氨基酸突變能夠提高酶活，可能的原因是氨基酸序列突變后，造成酶整體結構或局部結構的變化，而結構變化的結果可能導致底物更容易進入到酶的結合部位，從而更容易在結合部位結合，并在催化部位作用下相互縮合成酯。酶催化活性提高的原因也可能是氨基酸序列改變后，造成酶表面電荷的變化，表面電荷的變化更有利于酶催化合成酯。酶結構的改變也可能賦予了酯化酶更好的熱穩(wěn)定性，因而提高了酶的活性[25]。

圖3 突變菌株L1-70與原始菌株酯化酶的氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of lipase of mutant strain L1-70 and original strain

3 結論

本研究通過RT-PCR擴增出酯化酶基因，易錯PCR構建出高效酯化雜醇油的酯化酶。構建酯化酶的乙酸正丙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戌酯酶活分別是初始酯化酶酶活的2.28倍、2.42倍、2.29倍。構建的高效雜醇油酯化酶在釀酒行業(yè)具有重要的實際應用意義。解析酶的晶體結構，分子對接研究雜醇油高效酯化酶的分子動力學等是進一步研究的方向。