寧越，米雪，陳星伊，邵建航，昝林森,2

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SMAD1基因的沉默和過(guò)表達(dá)及對(duì)秦川牛原代成肌細(xì)胞生肌的影響

寧越1，米雪1，陳星伊1，邵建航1，昝林森1,2

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2國(guó)家肉牛改良中心，陜西楊凌 712100）

【目的】為了探索秦川牛（）SMAD1基因在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中的分子作用機(jī)制，通過(guò)研究沉默、過(guò)表達(dá)該基因后對(duì)牛原代成肌細(xì)胞分化及成肌相關(guān)基因表達(dá)量的影響，以期為BMP信號(hào)通路在牛肌肉組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā扛鶕?jù)Genbank牛（NM_001077107.2）已知序列設(shè)計(jì)并合成靶向沉默SMAD1基因的干擾序列si和陰性對(duì)照siRNA-NC。以秦川牛原代成肌細(xì)胞cDNA為模板，利用PCR技術(shù)克隆獲得SMAD1基因CDS序列，構(gòu)建腺病毒過(guò)表達(dá)穿梭載體pDC316-mCMV-EGFP-b。將腺病毒基因組質(zhì)粒和腺病毒載體穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK 293細(xì)胞中，通過(guò)Cre-loxp重組酶獲得重組腺病毒。獲得的攜帶目的基因的腺病毒標(biāo)記為AD-b，重組質(zhì)粒pDC316-EGFP標(biāo)記為AD-NC，用做對(duì)照組病毒，利用LaSRT法測(cè)定腺病毒的滴度。將獲得的干擾序列si和過(guò)表達(dá)腺病毒AD-b分別侵染秦川牛原代成肌細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SMAD1基因和成肌標(biāo)志基因、、的mRNA水平，并觀察對(duì)細(xì)胞分化融合情況的影響?！窘Y(jié)果】成功獲得了1條能有效沉默SMAD1基因siRNA，將其轉(zhuǎn)染秦川牛原代成肌細(xì)胞后進(jìn)行人工誘導(dǎo)分化，相比對(duì)照組，SMAD1基因分別下調(diào)了75.4%（誘導(dǎo)1d，<0.01）、66.7%（誘導(dǎo)3d，<0.01）、60.0%（誘導(dǎo)6d，<0.01）、54.7%（誘導(dǎo)9d，<0.01）。此外，還成功構(gòu)建了秦川牛SMAD1基因的腺病毒過(guò)表達(dá)穿梭載體，獲得了滴度為1×1010pfu/mL的過(guò)表達(dá)重組腺病毒AD-b。與對(duì)照組相比，高滴度過(guò)表達(dá)病毒AD-b侵染秦川牛原代成肌細(xì)胞0、1、3、6、9d后，與對(duì)照組相比，SMAD1基因的表達(dá)水平分別上調(diào)了2.10倍（誘導(dǎo)1d）、3.19倍（誘導(dǎo)3d）、105.3倍（誘導(dǎo)3d），<0.01）和144倍（誘導(dǎo)9d，<0.01）；結(jié)合肌管形成過(guò)程的變化和實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果證明，SMAD1基因促進(jìn)原代成肌細(xì)胞分化和肌管形成，并顯著上調(diào)成肌標(biāo)志基因、、的表達(dá)?！窘Y(jié)論】獲得了能有效沉默秦川牛原代成肌細(xì)胞表達(dá)的特異性的干擾序列si，以及可成功實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SMAD1基因的腺病毒介導(dǎo)的體外表達(dá)載體，可正向調(diào)控成肌細(xì)胞的分化和肌管形成過(guò)程。

SMAD1基因；RNAi；腺病毒載體；原代成肌細(xì)胞；肌管形成；秦川牛

0 引言

【研究意義】秦川牛（）是我國(guó)著名的地方黃牛品種，具有耐粗飼、抗逆性（?。┖?、肉質(zhì)好的優(yōu)點(diǎn)，但仍存在生長(zhǎng)慢、產(chǎn)肉量低且脂肪沉積欠佳等缺點(diǎn)[1]。隨著人們生活水平的不斷提高，牛肉供應(yīng)緊缺，提高牛肉的產(chǎn)量、質(zhì)量成為當(dāng)務(wù)之急[2-4]。【前人研究進(jìn)展】研究表明，骨骼肌生長(zhǎng)和肌內(nèi)脂肪含量對(duì)畜禽的產(chǎn)肉性能和肉質(zhì)有著至關(guān)重要的影響。TGF-β（transforming growth factor-β）信號(hào)通路主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移和凋亡，可介導(dǎo)組織與器官的正常生長(zhǎng)和發(fā)育（胚胎發(fā)育、骨骼器官形成）、機(jī)體的免疫反應(yīng)等生物過(guò)程，其在抑制脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞分化中的作用十分重要[5-6]。SMAD蛋白家族作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，直接參加與TGF-β超家族成員TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）、活化素等多個(gè)成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。目前，共有8種SMAD成員被報(bào)道（SMAD1-8），按照結(jié)構(gòu)和功能可分為3類[8-10]。第一類，特異性SMADs（亦稱receptor- activated SMAD，R-SMADs），包括SMAD1、2、3、5、8，其中SMAD1、5、8能被BMP-Ⅰ型受體（ALK1、2、3、6）磷酸化而激活，參與BMP信號(hào)通路；而SMAD2、3能被活化素或者TGFβ-Ⅰ型受體（ALK4、5）和孤兒Ⅰ型受體（ALK7）激活，作為TGF-β信號(hào)通路的直接作用底物，可對(duì)成肌因子及成肌分化過(guò)程起關(guān)鍵作用。第二類，共有型SMADs（common SMAD, C-SMAD），即SMAD4，它能與激活的R-SMADs形成異源的多聚復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控下游基因。第三類，抑制型SMADs（Ⅰ-SMADs），包括SMAD6、7，它們能抑制R-SMADs和C-SMAD復(fù)合物的活性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】BMP信號(hào)通路作為調(diào)控骨/軟骨形態(tài)發(fā)生的重要通路而被熟知。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)SMAD1/5/8通過(guò)參與BMP信號(hào)通路對(duì)調(diào)控肌肉量有著十分重要的作用[11]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在鼠的骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞核中定位到SMAD1、SMAD5、SMAD8蛋白，并且通過(guò)成年在鼠骨骼肌細(xì)胞中敲除SMAD1/5/8基因兩周后，觀察到其肌肉量減少了20%。此外，還有試驗(yàn)證實(shí)，BMP-SMAD1/5/8通路可通過(guò)與activin/ myostatin–SMAD2/3通路競(jìng)爭(zhēng)SMAD4從而促進(jìn)肌肉量及成肌分化過(guò)程[12]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】鑒于SMAD1基因的重要功能，本試驗(yàn)以秦川牛背最長(zhǎng)肌組織為試驗(yàn)材料，克隆秦川牛SMAD1基因，設(shè)計(jì)合成了RNA干擾序列、構(gòu)建了腺病毒過(guò)表達(dá)載體，獲得了具有干擾能力的RNA序列si和對(duì)有過(guò)表達(dá)能力的腺病毒AD-b，研究其在秦川牛成肌細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究該基因和BMP信號(hào)通路在秦川牛肌肉組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本研究于2016年9月至2018年4月在西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家肉牛改良中心完成。

1.1 試驗(yàn)材料

秦川牛第1代原代成肌細(xì)胞[13]、背最長(zhǎng)肌組織（第12—13肋骨間）均凍存于西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家肉牛改良中心種質(zhì)資源庫(kù)。所用試劑有：pDC316-mCMV- EGFP載體質(zhì)粒、JM109感受態(tài)細(xì)胞、Polyfectine轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自百恩維生物科技有限公司（中國(guó)，深圳）；DNA Polymerase、質(zhì)粒小提試劑盒、Trans2K Plus II DNA Marker購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司（中國(guó)，北京）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Endo-free Plasmid Kit購(gòu)自O(shè)mega Bio-tek股份有限公司（美國(guó)）；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶I、I購(gòu)自NEB有限公司（中國(guó)，北京）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、馬血清（HS）、胰蛋白酶Trypsin 0.25% EDTA、Lipofectamine? 3000購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)）；青鏈霉素雙抗購(gòu)自Gibco（美國(guó)）；腺病毒純化試劑盒ViraBind購(gòu)于Cell Biolabs公司（美國(guó)）；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with DNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR? Primix ExTMⅡ試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司（中國(guó)，北京）。

1.2 生物信息學(xué)分析

登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載包括牛（）等9種動(dòng)物的SMAD1氨基酸序列（表1）。利用DNAMan 6.0軟件進(jìn)行蛋白序列多重比對(duì)。

表1 9種物種SMAD1氨基酸序列信息

1.3 誘導(dǎo)分化秦川牛原代成肌細(xì)胞

復(fù)蘇第1代的秦川牛原代成肌細(xì)胞，差速貼壁兩次后進(jìn)行傳代培養(yǎng)至第3代，將細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，使用未誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（20%FBS+DMEM/F12）培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)到80%后用含2%HS的分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，隔日換液。

1.4 沉默秦川牛SMAD1基因

1.4.1 設(shè)計(jì)并合成siRNA 按照siRNA設(shè)計(jì)原則，以Genbank上牛SMAD1基因mRNA序列（NM_ 001077107.2），應(yīng)用Invitrogen公司在線設(shè)計(jì)工具（https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/）設(shè)計(jì)1條靶向沉默SMAD1基因的siRNA前體寡核苷酸序列和1條陰性對(duì)照序列（表2）。

表2 siRNA序列

1.5 過(guò)表達(dá)牛SMAD1基因

1.5.1 構(gòu)建秦川牛SMAD1基因腺病毒過(guò)表達(dá)載體 用Primer 5.0軟件根據(jù)牛SMAD1基因mRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物（表3），并在引物中引入酶切位點(diǎn)I和I。以原代成肌細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增CDS區(qū)序列，產(chǎn)物長(zhǎng)1 452 bp。PCR體系為：含模板的DNA 100ng、正反向引物各4μL、dNTP Mix（2.5mmol·L-1）4μL、polymerase 1μL、5×buffer 10μL，用滅菌蒸餾水補(bǔ)足50μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 3 min；95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切（I和I）回收后與pDC316-mCMV-EGFP真核表達(dá)載體大片段進(jìn)行連接，22℃反應(yīng)2h。反應(yīng)體系為：目的片段6μL、pDC316-mCMV-EGFP大片段2μL、10×DNA Ligase Buffer 1μL、T4 DNA Ligase 1μL。將上述連接產(chǎn)物取10μL與100μL JM109感受態(tài)細(xì)胞均勻混合，冰浴30min后42℃熱激45s，再立即冰浴2min，加入預(yù)熱至室溫的400μL LB培養(yǎng)基后37℃搖床培養(yǎng)1h，以4 000r/min離心1min后棄去400μL培養(yǎng)上清，再用移液器將剩余100μL吹打混勻后涂布于LB平板上（氨芐抗性含100μg·mL-1），37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取2個(gè)單克隆菌落并接種到5ml含氨芐抗性的LB培養(yǎng)液（氨芐濃度為100μg·mL-1）中，250r/min，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)I和I雙酶切鑒定無(wú)誤后，送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表3 PCR引物序列

1.5.2 pDC316-mCMV-EGFP-b和對(duì)照腺病毒包裝 將293細(xì)胞接種在6孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%—80%，用轉(zhuǎn)染試劑Polyfectine轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后觀察出毒跡象，即細(xì)胞收縮變圓，伴有細(xì)胞脫落。在大部分細(xì)胞病變并從培養(yǎng)瓶壁脫落后，作為病毒母液P1進(jìn)行收毒。

擴(kuò)增病毒AD-b。擴(kuò)增培養(yǎng)HEK 293細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%—90%匯合度時(shí)加入P1代病毒AD-b。在病毒侵染48h后收集細(xì)胞，在-80℃/37℃下冷凍/解凍3次，離心（10 000×g，10min）收集病毒上清，標(biāo)記為P2。用P2代病毒以相同方法擴(kuò)增病毒至P3代，再通過(guò)腺病毒純化試劑盒對(duì)P3代病毒純化。

PCR鑒定目的基因。收集P2代病毒，在沸水孵育10分鐘后立即置于冰上。短暫離心后，取上清液作模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR鑒定條件與擴(kuò)增目的基因相同。

1.5.3 病毒生物學(xué)滴度的測(cè)定 在滴度測(cè)定前一天將HEK 293細(xì)胞接種到48孔板中。用DMEM完全培養(yǎng)基10倍梯度稀釋病毒。具體做法如表4：在96孔板每孔中加入90μL培養(yǎng)基，向第一橫排孔中加入待測(cè)病毒原液各10μL，混勻后取10μL混合液轉(zhuǎn)至第二橫排孔，如此稀釋至第八橫排孔。取稀釋好的病毒混合液10μL加入相應(yīng)的48孔板中。侵染48h后，通過(guò)熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞情況。在最高稀梯度m的孔數(shù)出N個(gè)帶熒光的細(xì)胞，則病毒滴度為N×10m/mL（m為稀釋梯度），若N>10，則需繼續(xù)稀釋。

表4 病毒濃度梯度

1.5.4 測(cè)定腺病毒侵染細(xì)胞最佳MOI值 復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)室保存的第1代秦川牛原代成肌細(xì)胞，傳代培養(yǎng)后，將細(xì)胞以1×104個(gè)/孔鋪板至兩個(gè)24孔培養(yǎng)板中。分別加入不同劑量的腺病毒（MOI分別為25、50、75、100、125和150），每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，48 h后根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及綠色熒光的表達(dá)情況來(lái)確定最佳的侵染濃度。

1.5.5 腺病毒侵染秦川牛原代成肌細(xì)胞復(fù)蘇第1代秦川牛原代成肌細(xì)胞，傳代培養(yǎng)到第3代時(shí)，將細(xì)胞以2×105個(gè)/ 孔鋪至6孔培養(yǎng)板中，使用增殖培養(yǎng)基（20%FBS+ DMEM/F12）培養(yǎng)。試驗(yàn)共設(shè)計(jì)2個(gè)處理組，AD-b，AD-NC。當(dāng)原代成肌細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，根據(jù)測(cè)定的MOI值加毒，12h后換成成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；侵染48h后，替換成分化培養(yǎng)基并隔天換液。在培養(yǎng)的第0、1、3、6、9天時(shí)收集細(xì)胞，提取總RNA并觀察細(xì)胞分化融合情況。

俄羅斯一黨制向多黨制的過(guò)渡始于1991年葉利欽上臺(tái)執(zhí)政，其頒布的使俄羅斯政府機(jī)關(guān)非黨化的總統(tǒng)令亦使黨的新體制于蘇共二十八大期間得以確立。多黨制、政治多元化則在1993年獲得通過(guò)的俄羅斯聯(lián)邦憲法中被進(jìn)而確認(rèn)。自此在俄羅斯，多黨制得以合法化。

1.6 細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄PCR

用Trizol試劑提取處理第0、1、3、6、9天的成肌細(xì)胞總RNA，-80保存。用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)測(cè)定提取的細(xì)胞RNA的質(zhì)量。將質(zhì)量符合要求的RNA用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with DNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)，反應(yīng)得到的cDNA第一鏈保存于-20℃冰箱。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

各取1μg RNA，用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用SYBR?Primix ExⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR?Primix ExⅡ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA模板2 μL，dH2O 6 μL。反應(yīng)在7500 Real Time PCR儀（ABI公司）上進(jìn)行，具體循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，循環(huán)40次。熔解曲線程序?yàn)椋?95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3次試驗(yàn)重復(fù)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)SMAD1基因及肌分化標(biāo)志基因的表達(dá)。引物相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表3。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）”表示，利用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用檢驗(yàn)（-test）對(duì)不同試驗(yàn)處理之間的差異進(jìn)行顯著性分析，*＜0.05為差異顯著，**＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 物種間SMAD1蛋白質(zhì)序列比對(duì)

對(duì)反芻動(dòng)物、單胃動(dòng)物等9種不同物種的蛋白質(zhì)序列多重比較結(jié)果顯示：牛（）與山羊（）、綿羊（）、人（）、狗（）、豬（）SMAD1蛋白質(zhì)序列的相似性極高，均為99%；與小鼠（）、大鼠（）、雞（）SMAD1蛋白質(zhì)序列的相似性稍低，分別為98%、97%和96%。因此，不難看出SMAD1蛋白序列在各物種間十分保守（圖1）。

2.2 檢測(cè)沉默效率

提取si轉(zhuǎn)染牛原代成肌細(xì)胞第0、1、3、6、9天的細(xì)胞總RNA進(jìn)行qRT-PCR。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在轉(zhuǎn)染si后，SMAD1基因分別被下調(diào)了75.4%、66.7%、60.0%、54.7%（＜0.01，圖2）。結(jié)果表明，通過(guò)RNA干擾技術(shù)可有效降低成肌細(xì)胞SMAD1基因的mRNA水平，且沉默效率至少可持續(xù)至第9天。

100%一致性氨基酸位點(diǎn)用白色背景標(biāo)注，0%一致性的位點(diǎn)使用黑色背景標(biāo)注，具體保守性在下方line圖中

圖2 siSMAD1干擾效率檢測(cè)

2.3 構(gòu)建pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1腺病毒載體

以秦川牛成肌細(xì)胞cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增SMAD1基因CDS區(qū)序列，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，條帶清晰且符合預(yù)期（圖3-A）。將PCR產(chǎn)物膠回收后克隆到pDC316-mCMV-EGEP載體上，構(gòu)建pDC316-mCMV-EGFP-b腺病毒載體。質(zhì)粒雙酶切（I和I）后經(jīng)電泳鑒定，得到5 803bp和1 452bp兩條條帶，所得線性化質(zhì)粒和目的片段大小符合預(yù)期（圖3-B），同時(shí)測(cè)序結(jié)果也顯示pDC316-mCMV-EGFP-b腺病毒載體構(gòu)建成功。

2.4 包裝、擴(kuò)繁pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1和對(duì)照腺病毒

共轉(zhuǎn)染攜帶目的基因的重組質(zhì)粒pDC316- mCMV-EGFP-b和骨架質(zhì)粒到HEK293細(xì)胞中，在倒置熒光顯微鏡下觀察到（圖4 A-C）：轉(zhuǎn)染1d后有大量綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)；9d后出現(xiàn)彗星狀的熒光聚集現(xiàn)象；在12—14d后大部分細(xì)胞病變并從培養(yǎng)瓶壁脫落，將其收集為病毒母液P1。為了獲得強(qiáng)侵染能力的病毒，通過(guò)反復(fù)“侵染-凍融-收集”對(duì)病毒AD-b進(jìn)行大量擴(kuò)繁[14]。圖4-D是第3代純化后的腺病毒侵染細(xì)胞48 h時(shí)GFP表達(dá)情況。腺病毒滴度采用LaSRT法測(cè)定為1×1010pfu/mL。

A：秦川牛SMAD1基因CDS區(qū)序列PCR產(chǎn)物；B：pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果。M1：DL2000 DNA marker；M2：Trans2K plus marker；泳道1,2為SMAD1基因在兩種成肌細(xì)胞cDNA中的PCR產(chǎn)物；泳道3為pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1的NheI和NotI雙酶切鑒定結(jié)果

A：轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒到293細(xì)胞24h，GFP表達(dá)情況；B：轉(zhuǎn)染9天后，病變細(xì)胞開(kāi)始出毒，綠色熒光呈現(xiàn)葡萄串樣的聚集現(xiàn)象；C：AD-bSMAD1轉(zhuǎn)染14d以及AD-NC轉(zhuǎn)染12d時(shí)，大部分細(xì)胞收縮變圓，開(kāi)始從培養(yǎng)瓶壁脫落，將其收集為病毒母液P1；D：高滴度病毒（P3）侵染293細(xì)胞48h，GFP表達(dá)情況。原始放大倍數(shù)：40× (OLYMPUS IX71, 比例尺：200 μm)

2.5 測(cè)定腺病毒侵染細(xì)胞最佳MOI值

復(fù)蘇的秦川牛原代成肌細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后得到的第3代細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)多呈短梭形或多角形，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形。將其鋪至24孔培養(yǎng)板中，分別侵染不同劑量的腺病毒。48 h后在顯微鏡下觀察到AD-b，AD-NC的MOI值（multiplicity of infection, 侵染復(fù)數(shù)）分別為100和25時(shí)細(xì)胞GFP表達(dá)量較多且尚未出現(xiàn)明顯病變，因此確定此濃度為最佳侵染濃度。

2.6 檢測(cè)過(guò)表達(dá)效率

腺病毒AD-b侵染秦川牛前體成肌細(xì)胞第1、3、6、9天后，在熒光顯微鏡下觀察到95%以上的細(xì)胞可成功表達(dá)GFP。分別提取各時(shí)期細(xì)胞的總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SMAD1基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示SMAD1基因的表達(dá)量較對(duì)照組分別上調(diào)了約2.10倍（誘導(dǎo)1d）、3.19倍（誘導(dǎo)3d）、105.3倍（誘導(dǎo)6d，＜0.01）和144倍（誘導(dǎo)9d，＜0.01，圖5）。上述結(jié)果說(shuō)明所包裝的過(guò)表達(dá)腺病毒可有效升高SMAD1基因的mRNA水平，且過(guò)表達(dá)效率可至少持續(xù)至第9天。

2.7 SMAD1基因促進(jìn)秦川牛成肌細(xì)胞分化

顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染si第6天的牛原代成肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，處理組細(xì)胞的肌管形成過(guò)程較對(duì)照組明顯受損，所形成的肌管更小、更短、更少（圖6-A）。腺病毒AD-b侵染并誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化6天時(shí)，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，AD-b侵染組的細(xì)胞肌管的更大、更長(zhǎng)、更多（圖6-B）。由實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果知（圖6-C），與siRNA-NC相比，si處理組的肌分化標(biāo)志基因，和的mRNA水平均顯著下降（＜0.01）。反之，與對(duì)照組AD-NC相比，AD-b組的成肌標(biāo)志基因，和的mRNA水平均顯著升高（圖6-D，＜0.01）。以上結(jié)果表明，SMAD1基因能夠有效的正向調(diào)控秦川牛原代成肌細(xì)胞分化。

圖5 AD-bSMAD1過(guò)表達(dá)效率檢測(cè)

3 討論

大理石花紋作為衡量牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，主要受到肌肉和脂肪含量的比例影響。一直以來(lái)，人們對(duì)BMP信號(hào)通路的研究主要集中在骨的形成發(fā)育過(guò)程上，但自2013年起，其在調(diào)控肌肉發(fā)育上的重要功能開(kāi)始為人們了解。研究證明，BMP信號(hào)通路在調(diào)控成年后的肌肉量變化的重要作用主要是由SMAD1/5/8完成的[11-12]，且這條新的信號(hào)通路可以同廣泛存在的TGF-β通路的activin/myostatin– SMAD2/3軸競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SMAD4。這種競(jìng)爭(zhēng)作用，一方面可以降低activin/ myostatin–SMAD2/3的作用濃度，減少其對(duì)肌肉發(fā)育的抑制作用；另一方面可以增加BMP-SMAD1/5/8的優(yōu)勢(shì)作用。獲得優(yōu)勢(shì)的SMAD1/5/8磷酸化后可同SMAD4結(jié)合，進(jìn)而將信號(hào)從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)錄至細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)肌肉發(fā)育。

牛SMAD1基因定位在其17號(hào)染色體，編碼區(qū)長(zhǎng)1 398個(gè)堿基，共編碼465個(gè)氨基酸。本試驗(yàn)主要通過(guò)在秦川牛成肌細(xì)胞中下調(diào)、上調(diào)SMAD1基因表達(dá)量，觀察其對(duì)肌管融合過(guò)程及研究標(biāo)志基因在肌生成過(guò)程中作用，從而研究該基因在成肌分化中的重要作用。與傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)相比，RNA干擾（RNAi）是一種高效、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)的干擾技術(shù)。因此本試驗(yàn)首先設(shè)計(jì)并篩選到一條有效的siRNA。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染可有效下調(diào)目的基因的表達(dá)量，在轉(zhuǎn)染后的第1、3、6、9天分別下調(diào)了75.4%、66.7%、60.0%、54.7%（＜0.01）。說(shuō)明所合成的si可持續(xù)穩(wěn)定、高效得下調(diào)基因的mRNA水平，且該沉默水平可至少維持9d。另外，為了從另一角度研究基因功能，采取將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞從而實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)目的基因以觀察相關(guān)生理過(guò)程的變化。與脂質(zhì)體介導(dǎo)的化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染法、電轉(zhuǎn)移、核轉(zhuǎn)移等物理方法相比，這種過(guò)表達(dá)方法能直接將目的基因插入到病毒基因組中，再利用病毒的侵染性實(shí)現(xiàn)目的基因在真核細(xì)胞內(nèi)的過(guò)表達(dá)，最大程度的保護(hù)細(xì)胞保持良好狀態(tài)而不受損傷。20世紀(jì)中期，重組腺病毒載體作為一個(gè)新興的表達(dá)載體，開(kāi)始應(yīng)用于表達(dá)外源基因。與其他病毒載體系統(tǒng)相比，腺病毒載體系統(tǒng)可以有效地侵染原代細(xì)胞，并且可以侵染分裂期、非分裂期和增殖緩慢的細(xì)胞以及體內(nèi)組織，更易獲得高滴度病毒、可攜帶大片段外源基因而不與宿主基因組整合等[15-19]。腺病毒載體的這些優(yōu)點(diǎn)使其成為細(xì)胞試驗(yàn)最常用的病毒載體之一，也是基因表達(dá)和傳遞的主要候選載體[14, 20]。本試驗(yàn)采用秦川牛原代成肌細(xì)胞所提的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA為模板，在高保真酶的作用下成功克隆得到秦川牛SMAD1基因編碼區(qū)序列。為了更好地研究SMAD1基因在秦川牛肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控作用，本試驗(yàn)選用Ad5腺病毒改造的AdMaxTM重組腺病毒包裝系統(tǒng)，而不是前期使用的AdEasyTMAdenoviral Vector System。前期使用的這種腺病毒包裝系統(tǒng)需要將目的基因線性化后轉(zhuǎn)染到含有骨架載體pAd-Easy-1的.BJ5183大腸桿菌感受態(tài)中，再在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)腺病毒的重組[21-22]。而本試驗(yàn)采用的AdMaxTM系統(tǒng)是由Ad5腺病毒改建，不需要多次連接，可直接將共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中的腺病毒載體穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒在重組酶的作用下產(chǎn)生重組腺病毒，病毒包裝不需要不斷傳代就可獲得高滴度和高侵染效率的腺病毒[14, 23]。包裝成功的病毒擴(kuò)繁到第三代時(shí)滴度可達(dá)到1×1010pfu/mL。按MOI值（AD-b，AD-NC分別為100和25）侵染秦川牛原代成肌細(xì)胞第6和9天時(shí)，與對(duì)照組相比，SMAD1基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)了105.3倍（＜0.01）和144倍（＜0.01）。由此獲得了可有效調(diào)控基因表達(dá)的工具，si和AD-b，為下一步研究SMAD1基因在成肌分化過(guò)程中的作用奠定了強(qiáng)有力的基礎(chǔ)。

A：轉(zhuǎn)染siSMAD1并誘導(dǎo)分化6天時(shí)牛原代成肌細(xì)胞分化融合情況；B：侵染腺病毒AD-bSMAD1并成肌誘導(dǎo)分化6天時(shí)秦川牛原代成肌細(xì)胞分化融合情況；C：沉默SMAD1后肌分化標(biāo)志基因的mRNA水平檢測(cè)；D：過(guò)表達(dá)SMAD1后肌分化標(biāo)志基因的mRNA水平檢測(cè)。原始放大倍數(shù)：40× (OLYMPUS IX71, 比例尺：200 μm)

骨骼肌分化是一類由多種信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[24-26]。成肌因子能夠誘導(dǎo)肌肉干細(xì)胞的激活和終末分化，在成肌增殖和分化中發(fā)揮重要作用。在成肌發(fā)生的早期階段，甚至是在增殖的成肌細(xì)胞分化前，MyoD和Myf5作為成肌分化的早期決定因子首先被激活。MyoD在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的自我更新和增殖方面起到至關(guān)重要的作用[27]。已有研究表明，在肌衛(wèi)星細(xì)胞中缺失 MyoD，會(huì)使衛(wèi)星細(xì)胞更傾向于自我的更新交替，而不會(huì)進(jìn)行細(xì)胞的融合形成肌管[28]。MyoD被激活后可進(jìn)而調(diào)控下游成肌基因MyoG的表達(dá)，是在成肌終末分化期起決定性作用的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而促進(jìn)肌管的形成[29-32]。最新研究表明，SMAD1對(duì)成年后肌肉量的調(diào)控十分關(guān)鍵，但其具體的調(diào)控機(jī)制及在肌肉形成過(guò)程中的功能還不甚清楚。為了更好地研究SMAD1基因的作用機(jī)制，本試驗(yàn)利用前期獲得的有效RNA干擾序列和高滴度腺病毒侵染秦川牛原代成肌細(xì)胞，通過(guò)對(duì)SMAD1基因mRNA水平表達(dá)量及細(xì)胞分化融合情況觀察，發(fā)現(xiàn)SMAD1基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)染si后的誘導(dǎo)分化1—9d內(nèi)均極顯著低于對(duì)照組，但是誘導(dǎo)1—6d的干擾效率在60%以上，而第9天的干擾效率有所下降（為54.7%），此外，在誘導(dǎo)第6天時(shí)成肌細(xì)胞的分化過(guò)程已呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞表型（具體表現(xiàn)為肌管融合過(guò)程明顯受損，所形成的肌管更小更少更短）；而過(guò)表達(dá)SMAD1基因后其mRNA水平從細(xì)胞誘導(dǎo)分化的第六天開(kāi)始顯著上調(diào)且超過(guò)100倍，對(duì)照組相比，所形成的肌管與更多、更長(zhǎng)。因此，綜合干擾、過(guò)表達(dá)SMAD1基因后其mRNA水平和細(xì)胞表型的變化來(lái)看，誘導(dǎo)分化第6天都是一個(gè)很重要且有效的時(shí)間點(diǎn)，可以作為后續(xù)檢測(cè)標(biāo)志基因的時(shí)間點(diǎn)。另外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果證明，SMAD1基因可正向調(diào)控成肌基因、的表達(dá)。以上結(jié)果提示，很有可能參與了成肌分化的早期/終末期調(diào)控，是成肌分化的一個(gè)正向調(diào)控基因。而對(duì)、的準(zhǔn)確調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究成功篩選到靶向沉默秦川牛SMAD1基因的RNA干擾序列si，同時(shí)成功構(gòu)建了秦川牛SMAD1基因過(guò)表達(dá)重組腺病毒載體。通過(guò)在秦川牛原代成肌細(xì)胞中沉默、過(guò)表達(dá)SMAD1基因，檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，證實(shí)SMAD1基因可正向調(diào)控原代成肌細(xì)胞分化。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Silencing and Overexpressing SMAD Family Member 1 () Gene and Its Effect on Myogenesis in Primary Myoblast of Qinchuan Cattle ()

NING Yue1, MI Xue1, CHEN XingYi1, SHAO JianHang1, ZAN LinSen1,2

(1College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2National Beef Cattle Improvement Center, Yangling 712100, Shaanxi)

【Objective】The aims of the present study were to investigate molecular function ofgene in the bovine myoblast cell differentiation and to explore its role in the growth and development of Qinchuan cattle for beef production.【Method】SMAD1 gene was silenced and overexpressed through RNA interference and adenovirus recombinant over expression vector containingThe negative control siRNA-NC and RNA interference specific targeted SMAD1 gene (si) were designed and synthesized against the bovinemRNA sequence (CDS), which was obtained by RT-PCR using cDNA of Qinchuan cattle myoblast as template, and then, which was inserted into a shuttle vector pDC316-mCMV-EGFP to construct the over expression of adenovirus shuttle vector pDC316-mCMV-EGFP-b. Adenovirus genome plasmid and adenovirus shuttle vectors were cotransfected into HEK293 cell line to pack and obtain recombinant adenovirus. Adenovirus containing target gene was named as AD-b,whilepDC316-EGFP was used as a reference vector and was considered as control group "AD-NC". Their titers were tested by using LaSRT method. Bovine myoblast were transfected with siand AD-b, the mRNA level of SMAD1 gene and myogenesis-related genes, such as,and, were detected by real-time quantitative PCR, and the impact on myotube formation was observed. 【Result】The mRNA level of SMAD1gene transfected with siRNA was reduced 75.4% (induced differentiation for 1 day,<0.01), 66.7% (induced differentiation for 3 days,<0.01), 60.0% (induced differentiation for 6 days,<0.01), 54.7% (induced differentiation for 9 days,<0.01), respectively, compared with the siRNA-NC. The optimum titer of AD-binfectious was found at 1×1010pfu/mL. The expression levels ofwere rapidly increased 2.10 (induced differentiation for 1 day), 3.19 (induced differentiation for 3 days), 105.3 (induced differentiation for 6 days,<0.01) and 144 (induced differentiation for 9 days,<0.01) times of the control group after infected by AD-b, respectively. In addition, both myotube formation and qRT-PCR results proved that SMAD1 gene promoted myoblasts differentiation and myotube formation, as well as the mRNA expression level of,and. 【Conclusion】We could conclude from the present study thatSMAD1 gene performed its function in the myoblast differentiation and myotube formation. Based upon these findings, SMAD1 gene could be used as potential marker for the breed improvement of Qinchuan cattle through marker assisted selection for beef production.

mothers against decapentaplegic homolog 1 gene (); siRNA; adenovirus vector; primary myoblast; myotube formation; Qinchuan cattle

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.10.014

2018-12-06；

2019-02-26

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0501700）、國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-37）、陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃（2016KTCL02-15）

寧越，E-mail：ningyueny@163.com。通信作者昝林森，E-mail：zanlinsen@163.com