孫怡寧 馮秀媛 曾令霞 羅靜 王亞文 李娜 何嵐*

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，陜西 西安 710061 2.西安交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)和生物統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，陜西 西安 710061 3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710061

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性進(jìn)行性多關(guān)節(jié)炎為特征的系統(tǒng)性自身免疫病，全身骨質(zhì)疏松是RA病程發(fā)展過(guò)程中重要的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，最常見(jiàn)的發(fā)病部位是腰椎、股骨和前臂[1]。早期或初發(fā)RA患者即可發(fā)生骨質(zhì)疏松和骨量減低[2]。長(zhǎng)病程RA患者與對(duì)照組相比，其骨質(zhì)疏松發(fā)生率將增加2倍，椎體骨質(zhì)疏松的發(fā)生率為19%～32%，髖部骨質(zhì)疏松的發(fā)生率為7%～26%[3]。全身骨量丟失造成RA患者脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高，通過(guò)對(duì)絕經(jīng)后女性RA患者的隨訪觀察研究[4]表明，5年內(nèi)有19%的患者出現(xiàn)新發(fā)椎體骨折，16 %的患者出現(xiàn)新發(fā)非椎體骨折。RA患者髖部骨折的風(fēng)險(xiǎn)最高，腕關(guān)節(jié)、肱部、髖部和骨盆骨折的發(fā)生率比非RA人群高1.5倍[5]。

骨量的維持取決于破骨細(xì)胞的骨吸收和成骨細(xì)胞的骨形成處于動(dòng)態(tài)平衡，破骨細(xì)胞的骨吸收增加是RA患者全身骨量丟失的主要原因[6]。破骨細(xì)胞起源于骨髓單核/巨噬細(xì)胞系(bone marrow derived monocyte/macrophage lineage cells，BMMs)，核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面核因子-κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)的結(jié)合在誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用[7]。骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)(bone turnover markers，BTMs)是骨吸收和骨形成過(guò)程中產(chǎn)生、釋放的蛋白質(zhì)和基質(zhì)降解產(chǎn)物，血清I型膠原羧基端交聯(lián)肽(C-terminal telopeptide of type I collagen，I-CTX)和I型膠原氨基端前肽(aminoterminal propeptide of type I collagen，PINP)目前被認(rèn)為是分別代表破骨細(xì)胞骨吸收和成骨細(xì)胞骨形成最好的BTMs[8]。Fardellone等[9]發(fā)現(xiàn)血清RANKL、I-CTX能較好地反映RA患者全身骨吸收水平，PINP則能更好地反映接受TNF-α抑制劑(TNF-α inhibitors，TNFi)治療的RA患者的治療反應(yīng)。

免疫炎癥是引起RA患者全身骨量丟失的重要原因之一，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素-6(interleukin，IL-6)不僅是引起RA關(guān)節(jié)炎的主要炎性細(xì)胞因子，同時(shí)參與RA患者全身的骨重建。TNF-α促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)RANK，刺激成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、T、B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和表達(dá)RANKL，是破骨細(xì)胞分化的刺激因子[10]。TNF-α與RANKL可以協(xié)同作用誘導(dǎo)BMMs分化為成熟破骨細(xì)胞[11]。通過(guò)對(duì)IL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的研究[12]發(fā)現(xiàn)，IL-6促進(jìn)了破骨細(xì)胞分化、降低成骨細(xì)胞活性導(dǎo)致小鼠骨吸收增加、全身骨量丟失。臨床研究[13-14]證實(shí)，抗TNF-α和抗IL-6生物制劑可以阻止RA患者全身骨丟失，使骨形成指標(biāo)升高、骨吸收指標(biāo)下降，進(jìn)一步證實(shí)炎性細(xì)胞因子在引起RA患者全身骨量丟失中發(fā)揮了作用。本研究擬納入符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism，ACR/EULAR)RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)的患者，通過(guò)檢測(cè)患者血清TNF-α、IL-6、RANKL、I-CTX、PINP水平以及腰椎和髖部骨密度，分析炎性細(xì)胞因子、BTMs與腰椎和髖部骨密度的相關(guān)性，探討免疫炎癥、骨重建在RA患者全身骨量丟失中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

納入2017年1月至2018年1月就診于我院風(fēng)濕免疫科、符合2010年 ACR/EULAR RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)、年齡 ≥ 18歲的RA患者117例，其中男性38例，女性79例，平均年齡(54.24±13.39)歲。將RA患者分為初治組即未使用任何藥物或僅間斷使用非甾體抗炎藥的初發(fā)未治療患者[41例，平均病程(25.15±46.29)個(gè)月]和復(fù)治組即曾使用糖皮質(zhì)激素和(或)傳統(tǒng)緩解病情抗風(fēng)濕藥和(或)生物制劑和(或)雙膦酸鹽的患者[76例，平均病程(130.06±124.06)個(gè)月]。對(duì)照組選擇同時(shí)期在我院體檢中心查體的健康人群51名，其中男性18名，女性33名，平均年齡(40.53±7.26)歲。

1.2 血清TNF-α、IL-6和RANKL檢測(cè)

收集RA患者和健康對(duì)照人群的清晨空腹靜脈血，分離血清，-80 ℃冰箱保存。按人TNF-α、IL-6和RANKL ELISA試劑盒(欣博盛生物公司)說(shuō)明書(shū)操作，在抗體包被的酶標(biāo)板(96孔)上依次每孔加入血清100 μL、生物素化的抗體100 μL、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素100 μL、顯色底物100 μL，經(jīng)洗滌、孵育后在酶標(biāo)儀(BioTek，ELX800)450 nm處進(jìn)行測(cè)定。

1.3 血清I-CTX和PINP檢測(cè)

收集RA患者清晨空腹靜脈血，分離血清，按人I-CTX和抗PINP電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(羅氏公司)說(shuō)明書(shū)操作。首先將50 μL血清與生物素化抗I-CTX和抗PINP單克隆抗體混勻，然后加入鏈霉親和素包被的微粒和釕標(biāo)記的抗I-CTX與抗PINP單克隆抗體，將反應(yīng)混合液吸入到測(cè)量池，采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(cobase e 602)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 骨密度檢測(cè)

采用雙能X線骨密度儀(LEXXOS-LX381, 法國(guó)DMS)測(cè)量患者腰椎(L1～4)和髖部骨密度。操作由一名專(zhuān)業(yè)人員完成，腰椎骨密度重復(fù)測(cè)量準(zhǔn)確性為0.16 %，髖部骨密度重復(fù)測(cè)量準(zhǔn)確性為0.15 %。骨密度以數(shù)值(g/cm2)和標(biāo)準(zhǔn)差(T值)的形式表示，根據(jù)WHO骨密度測(cè)量診斷標(biāo)準(zhǔn)即T<-1.0為骨量減低，T≤-2.5為骨質(zhì)疏松。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RA患者骨密度比較

初治組RA患者中腰椎和(或)髖部骨量減低者占46.3%、骨質(zhì)疏松者為24.4%，腰椎骨質(zhì)疏松者為24.4%，髖部骨質(zhì)疏松者為5.2%。復(fù)治組RA患者腰椎和(或)髖部骨量減低者占28.9%、骨質(zhì)疏松者為44.7%，腰椎骨質(zhì)疏松者為45.5%，髖部骨質(zhì)疏松者為10.7%，見(jiàn)表1。

表1 RA患者腰椎和髖骨密度比較Table 1 Bone mineral density of the lumbar spine and total hip in the patients with rheumatoid arthritis

2.2 RA患者與正常對(duì)照人群血清TNF-α、IL-6和RANKL比較

初治組RA患者血清TNF-α和IL-6水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(26.07±46.76)pg/mL,(11.45±4.18)pg/mL,Z=-0.876,P=0.381;(7.50±5.17)pg/mL,(9.43±7.99)pg/mL,Z=-1.799,P=0.072];復(fù)治組RA患者血清TNF-α和IL-6水平較對(duì)照組顯著增高[(22.63±33.55)pg/mL,(11.45±4.18)pg/mL,Z=-2.038,P=0.042;(10.38±17.69)pg/mL,(9.43±7.99)pg/mL,Z=-3.086,P=0.002]。意料之外的是，初治組RA患者和復(fù)治組RA患者血清RANKL均明顯低于對(duì)照組[(16.11±8.06)pg/mL,(15.10±6.30)pg/mL,(20.81±22.22)pg/mL;Z=-2.058,P=0.040;Z=-3.028,P=0.002]。見(jiàn)圖1。

圖1 RA患者和健康對(duì)照血清TNF-α、IL-6和RANKL比較Fig.1 Serum levels of TNF-α, IL-6, and RANKL in RA patients and the controls

2.3 RA患者血清TNF-α、IL-6與骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的相關(guān)性

初治組RA患者血清TNF-α和IL-6與骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)RANKL、I-CTX、PINP均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05);復(fù)治組RA患者血清TNF-α與血清RANKL水平呈顯著正相關(guān)(r=0.451,P=0.000)，而與血清I-CTX和PINP無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05);復(fù)治組RA患者血清IL-6與血清RANKL、I-CTX、PINP均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。

2.4 RA患者血清TNF-α和IL-6與骨密度的相關(guān)性

初治組RA患者血清TNF-α和IL-6與患者腰椎和髖部骨密度無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05);復(fù)治組RA患者血清TNF-α與患者腰椎和髖部骨密度無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05);復(fù)治組RA患者血清IL-6與患者腰椎骨密度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.236,P=0.040)，而與患者髖部骨密度無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。

2.5 RA患者血清BTMs與骨密度的相關(guān)性

初治組RA患者血清RANKL與患者腰椎和髖部骨密度無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，血清I-CTX、PINP與患者髖部骨密度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.332,P=0.042;r=-0.482,P=0.003)，與腰椎骨密度無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05);復(fù)治組RA患者血清RANKL、I-CTX、PINP與患者腰椎和髖部骨密度均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。

3 討論

RA是以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要病理特征的系統(tǒng)性自身免疫病，RA引起的骨損害表現(xiàn)在3個(gè)方面：受累關(guān)節(jié)骨侵蝕、受累關(guān)節(jié)骨質(zhì)疏松和全身骨量丟失[15]?！肮敲庖邔W(xué)”研究[16]發(fā)現(xiàn)，RA發(fā)病與病程中的免疫炎癥和異常的自身免疫干擾了正常的骨轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致RA患者全身骨量丟失。此次研究中發(fā)現(xiàn)，初治組RA患者中骨量減低的患者比例較復(fù)治組增多(46.3%; 28.9%)，而復(fù)治組RA患者中骨質(zhì)疏松的患者比例較初治組增多(44.7%; 24.4%)，兩組患者腰椎骨質(zhì)疏松的比例較髖部骨質(zhì)疏松的比例更高，這些結(jié)果與筆者前期關(guān)于初發(fā)結(jié)締組織病患者低骨量的研究結(jié)果基本一致[17]。復(fù)治組RA患者并發(fā)骨質(zhì)疏松比例較初治組患者增高可能與病程長(zhǎng)、疾病控制不佳、既往使用糖皮質(zhì)激素等藥物有關(guān)。

在此次研究中首先對(duì)比了初治組RA患者、復(fù)治組RA患者和正常對(duì)照人群血清TNF-α、IL-6與RANKL水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然初治組RA患者血清TNF-α和IL-6水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異，但復(fù)治組RA患者血清TNF-α和IL-6水平較對(duì)照組均顯著增高，說(shuō)明RA患者具有以T細(xì)胞免疫異常為特征的慢性炎癥的持續(xù)存在。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[18]均發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以促進(jìn)RANKL/RANK表達(dá)和相互作用，與RANKL協(xié)同作用誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟。對(duì)RA小鼠模型的研究[19]表明，IL-6增加了小鼠脛骨骨髓中破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的數(shù)量，抗IL-6受體抗體顯著抑制了小鼠全身骨丟失。在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠模型IL-6抑制椎體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞形成[20]。對(duì)RA患者十年的隨訪研究[21]證實(shí)了有效地抗炎治療可以減少患者股骨頸、髖和腰椎骨密度的下降。相關(guān)性分析顯示患者體質(zhì)量指數(shù)、吸煙和女性患者的絕經(jīng)狀態(tài)在初治和復(fù)治RA患者中與BTMs和骨密度均無(wú)顯著相關(guān)性。筆者進(jìn)一步對(duì)血清TNF-α、IL-6與BTMs和骨密度進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)治組RA患者血清TNF-α與骨吸收指標(biāo)RANKL水平呈顯著正相關(guān)(r=0.451,P=0.000)，血清IL-6與患者腰椎骨密度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.236,P=0.040)。可見(jiàn)長(zhǎng)病程復(fù)治RA患者的TNF-α和IL-6可能與破骨細(xì)胞骨吸收增加有關(guān)，并且在引起全身骨量丟失中發(fā)揮作用。

RANKL是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞分化最主要的成分，但此次研究中無(wú)論是初治組還是復(fù)治組，RA患者的血清RANKL均明顯低于對(duì)照組，這一結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道不同。Johansson等[22]發(fā)現(xiàn)，在RA患者癥狀發(fā)生前數(shù)年即可有RANKL水平的增高。ACPA陽(yáng)性的早期未治療RA患者血清RANKL水平明顯高于ACPA陰性患者，并且血清RANKL水平與關(guān)節(jié)骨侵蝕相關(guān)[23]。RANKL分為膜結(jié)合型和可溶性，可溶性RANKL調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化的作用相對(duì)弱[24]，成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等表達(dá)的膜結(jié)合型RANKL激活破骨細(xì)胞前體細(xì)胞RANK信號(hào)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的主要途徑[7]。除此以外，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)可以做為RANKL的誘餌受體抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化[25]。因此，在早期初發(fā)RA患者全身骨量丟失中血清可溶性RANKL發(fā)揮怎樣的作用仍有待進(jìn)一步研究。BTMs與骨密度的相關(guān)分析表明，初治RA患者血清骨吸收指標(biāo)I-CTX和骨形成指標(biāo)PINP與患者髖部骨密度呈顯著負(fù)相關(guān)，由于骨重建過(guò)程中破骨細(xì)胞骨吸收和成骨細(xì)胞骨形成的時(shí)空偶聯(lián)[26]，進(jìn)一步說(shuō)明骨轉(zhuǎn)換增高在引起初發(fā)未治療RA患者髖部骨量丟失中發(fā)揮了作用。

此次研究結(jié)果表明，骨轉(zhuǎn)換增高可能是引起初治RA患者髖部骨量丟失的原因。復(fù)治RA患者持續(xù)存在的慢性炎癥可能通過(guò)增加破骨細(xì)胞骨吸收引起腰椎骨量丟失。此次研究的不足之處在于，初治組RA患者例數(shù)相對(duì)較少，難以對(duì)RA患者進(jìn)行抗環(huán)瓜氨酸肽抗體陽(yáng)性或陰性、類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性或陰性，性別、絕經(jīng)前或絕經(jīng)后等進(jìn)一步的分層分析。另外，對(duì)照組僅納入了健康人群，如能納入年齡和性別分布與RA患者相匹配的骨關(guān)節(jié)炎患者做為對(duì)照會(huì)更佳。因此，進(jìn)一步擴(kuò)大入組RA患者樣本量，增加不同的人群作為對(duì)照，對(duì)患者進(jìn)行更加詳細(xì)的分層分析將是下一步研究的方向。