吳繼云, 陳偉南**, 蔣春華

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第904醫(yī)院 & 無錫市太湖醫(yī)院， 江蘇 無錫 214000; 2.廣西醫(yī)科大學(xué)， 廣西 南寧 530021)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis,OP)是全身性的骨骼疾病，臨床典型表現(xiàn)為腰背和四肢關(guān)節(jié)疼痛，病理學(xué)檢查以骨密度降低為特征，導(dǎo)致骨骼脆性和骨折危險(xiǎn)性增高。50 歲以上人群骨質(zhì)疏松發(fā)病率超過50%，已被公認(rèn)為嚴(yán)重的社會(huì)公共健康問題[1-3]。近年來，中藥具有療效確切和副作用小等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于臨床骨質(zhì)疏松的治療，相關(guān)研究也日益增多。仙靈骨葆膠囊是收錄于現(xiàn)行《國(guó)家基本藥物目錄》并常用于骨傷科骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松癥相關(guān)骨折的中成藥，具有滋補(bǔ)肝腎，活血通絡(luò)及強(qiáng)筋健骨的功效[4-5]。隨著人們對(duì)骨折愈合機(jī)制研究深入，認(rèn)識(shí)到一些細(xì)胞因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor beta,TGF-β)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在骨折愈合中發(fā)揮了獨(dú)特的作用，骨折患者其較快的骨折愈合時(shí)間可能與血清中PDGF、TGF-β和VEGF水平升高有關(guān)[6-8]。仙靈骨葆膠囊在治療老年骨質(zhì)疏松的機(jī)理是否與上述因子相關(guān)仍需要進(jìn)一步確認(rèn)，本課題以去勢(shì)后骨質(zhì)疏松性骨折老齡大鼠模型為研究對(duì)象，考察仙靈骨葆膠囊對(duì)骨折愈合過程PDGF、TGF-β和VEGF表達(dá)的影響，為仙靈骨葆膠囊的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料及方法

1.1 受試動(dòng)物

6月雌性SD大鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)為SCXK(京)2006.0009，體質(zhì)量280～450 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、去勢(shì)組、仙靈骨葆膠囊高劑量組(高劑量組)和仙靈骨葆膠囊低劑量組(低劑量組)，每組16只。所有大鼠均自由進(jìn)食飲水，定期消毒和通風(fēng)，1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

仙靈骨葆膠囊(貴州同濟(jì)堂制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025337，0.5 g/粒)。PDGF、TGF-β和bFGF兔抗大鼠單克隆抗體、生物素化山羊抗兔IgG均購(gòu)自武漢博士德公司?？偟鞍锥繙y(cè)定試劑盒(南京建成生物公司)，LEICARM2235 型石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)，BX50生物顯微鏡(日本Olympus公司)，大鼠固定板，克氏針和手術(shù)器械等。

1.3 骨質(zhì)疏松及骨折模型的制備

全身麻醉后，去勢(shì)組和高、低劑量組大鼠，切開雙側(cè)腰背部，暴露腹腔，行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。假手術(shù)組切開雙側(cè)腰背側(cè)，切除腹腔少許脂肪即可。術(shù)后8周，所有動(dòng)物全身麻醉，暴露右側(cè)股骨，經(jīng)骸韌帶行克氏針?biāo)枨荒嫘胁?nèi)固定，將股骨中段切斷，制成骨折模型。術(shù)后所有大鼠獨(dú)籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.4 給藥

骨折造模術(shù)后第2天高劑量組和低劑量組分別給予0.6及0.3 g/kg仙靈骨葆膠囊，假手術(shù)組和去勢(shì)組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)10周。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1體質(zhì)量 檢測(cè)4組大鼠骨折前、骨折后2周～8周的體質(zhì)量。

1.5.2骨痂、骨細(xì)胞指數(shù)與破骨細(xì)胞指數(shù) 骨折模型建立后2、4、8和10周，每組隨機(jī)選取4只大鼠，安樂處死，截取右股骨中段骨癡組織，以10%中性甲醛固定，脫鈣6周，正中剖開，階梯濃度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，染色，鏡下觀察骨折后不同時(shí)期骨癡的組織學(xué)改變，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)成骨細(xì)胞指數(shù)與破骨細(xì)胞指數(shù)。

1.5.3骨折周圍的軟組織的PDGF、TGF-β和VEGF表達(dá) 骨折造模10周后，收集骨折周圍的軟組織，包括肌肉及纖維組織等，采用western blot法檢測(cè)骨折周圍的軟組織的PDGF、TGF-β和VEGF表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量

雙側(cè)卵巢切除術(shù)術(shù)后6周，大鼠無明顯動(dòng)情周期，表明去勢(shì)大鼠模型制作成功，同時(shí)術(shù)后6周隨機(jī)選取每組大鼠3只連續(xù)7 d行陰道細(xì)胞學(xué)涂片，鏡下觀察顯示涂片的白細(xì)胞及炎性細(xì)胞增多，上皮細(xì)胞以底層細(xì)胞為主，無角化細(xì)胞，則進(jìn)一步證實(shí)去勢(shì)大鼠制作成功。各組大鼠骨折前、骨折后2～8周的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)；骨折10周，與假手術(shù)組比，其余3組大鼠體質(zhì)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠骨折前及骨折后2、4、8和10周的體質(zhì)量Tab.1 Body mass of rats in each group before and 2, 4, 8 and 10 weeks after fracture

(1)與假手術(shù)組比較，P<0.05

2.2 骨痂、骨細(xì)胞指數(shù)與破骨細(xì)胞指數(shù)

骨折后，去勢(shì)組纖維性骨痂和軟骨骨痂明顯多于假手術(shù)組、高劑量組和低劑量組。假手術(shù)組骨折后各時(shí)點(diǎn)骨細(xì)胞指數(shù)及破骨細(xì)胞指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；骨折后2周時(shí)，除假手術(shù)組，其余組的骨細(xì)胞指數(shù)與破骨細(xì)胞指數(shù)均有不同程度地增高，至4周時(shí)達(dá)峰值，第8、10周時(shí)降低；但與假手術(shù)組比較，其余3組骨折后的骨細(xì)胞指數(shù)與破骨細(xì)胞指數(shù)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與去勢(shì)組比較，低劑量組和高劑量組骨細(xì)胞指數(shù)與破骨細(xì)胞指數(shù)均有不同程度地增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組骨細(xì)胞指數(shù)與破骨細(xì)胞指數(shù)均有不同程度地增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠骨折后2、4、8和10周時(shí)骨細(xì)胞指數(shù)與破骨細(xì)胞指數(shù)個(gè)/μm2，n=4)Tab.2 Osteocyte index and osteoclast index at 2, 4, 8 and 10 weeks after fracture in rats of each group

注：(1)與假手術(shù)組比較，P<0.05；(2)與去勢(shì)組比較，P<0.05；F1和P1為4組的骨細(xì)胞指數(shù)統(tǒng)計(jì)值，F(xiàn)2和P2為4組的破骨細(xì)胞指數(shù)統(tǒng)計(jì)值

2.3 骨折周圍軟組織PDGF、TGF-β和VEGF水平

假手術(shù)組骨折2、4、8、10周時(shí)骨折周圍軟組織的PDGF、TGF-β和VEGF差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。骨折后2周時(shí)，除假手術(shù)組，其余3組的PDGF、TGF-β和VEGF均有不同程度增高 (P<0.05)，至4周時(shí)達(dá)峰值，第8～10周降低；與去勢(shì)組比較，低劑量組和高劑量組的PDGF、TGF-β和VEGF均有不同程度地增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組的PDGF、TGF-β和VEGF均有不同程度地增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表3。

注：A為假手術(shù)組，B為去勢(shì)組，C為低劑量組，D為高劑量組圖1 各組大鼠骨折后 2、4、8和10周骨折周圍軟組織的PDGF、TGF-β和VEGF表達(dá)量Fig.1 Expressions of PDGF, TGF-beta and VEGF in soft tissues around fracture at 2, 4, 8 and 10 weeks after fracture in rats of each group

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是多種原因引起的以骨量降低、骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化為主要病理特征的疾病，可導(dǎo)致骨脆性增高，骨折危險(xiǎn)性增加。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是最常見的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，絕經(jīng)后女性的患病率接近50%，與同齡非骨質(zhì)疏松者比，骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加至少20%[9]。如何改善骨質(zhì)疏松，降低骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的骨折發(fā)生率及加速骨質(zhì)疏松骨折的愈合是骨科的研究熱點(diǎn)。本研究制備老齡大鼠去勢(shì)后骨質(zhì)疏松性骨折模型，給予高、低劑量仙靈骨葆膠囊，結(jié)果顯示，仙靈骨葆膠囊可能通過調(diào)節(jié)骨折周圍軟組織PDGF、TGF-β和VEGF的相對(duì)表達(dá)量而達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的效果。

骨愈合為骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的重新獲得及骨連續(xù)性恢復(fù)。組織方面，骨折愈合包括血腫炎癥機(jī)化期、原始骨痂反應(yīng)期及骨形成改建期。在骨折愈合過程較為復(fù)雜，許多因子參與其中，研究較多且較典型的因子有PDGF、TGF-β和VEGF，健康志愿者體內(nèi)上述因子多為低表達(dá)，但在應(yīng)激條件，上述因子明顯增加。PDGF在人體的平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等均有表達(dá)，具有強(qiáng)大的促有絲分裂原的作用，另外，PDGF的趨化作用強(qiáng)，作用在骨折區(qū)域的間充質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，合成Ⅰ型膠原，促進(jìn)骨折周圍軟骨細(xì)胞增生[10-11]。VEGF與血管新生有明顯的相關(guān)性，具有促進(jìn)新生血管形成，改善機(jī)體局部供給氧氣與營(yíng)養(yǎng)，當(dāng)骨折發(fā)生時(shí)，骨和骨周邊軟組織遭到破壞，血管斷裂，機(jī)體反饋性大量分泌VEGF，已發(fā)揮VEGF的促血管生成效果。動(dòng)物研究顯示，局部應(yīng)用 bFGF 及重組PDGF有助于加速骨折愈合[12]。TGF-β是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞因子，具有多方面的作用，主要體現(xiàn)在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、改善瘢痕和纖維化。TGF-β可由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分泌生成，骨組織中，TGF-β一般以無活性的方式存在于骨基質(zhì)，當(dāng)骨環(huán)境被破壞，如破骨細(xì)胞破壞骨基質(zhì)，TGF-β被激活，立即參與抑制破骨細(xì)胞活性，同時(shí)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)骨的修復(fù)和愈合，促進(jìn)TGF-β分泌，即可促進(jìn)骨折愈合[13-14]。

表3 各組大鼠骨折后2、4、8和10周骨折軟組織的PDGF、TGF-β和VEGF表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of PDGF, TGF-beta and VEGF in soft tissues around fracture at 2, 4, 8 and 10 weeks after fracture in rats of each group

注：(1)假手術(shù)組比較，P<0.05；(2)與去勢(shì)組比較，P<0.05；F1和P1為4組的PDGF統(tǒng)計(jì)值，F(xiàn)2和P2為4組的TGF-β統(tǒng)計(jì)值，F(xiàn)3和P3為4組的VEGF統(tǒng)計(jì)值

仙靈骨葆膠囊是依據(jù)苗族民間的經(jīng)驗(yàn)方研制而制得的現(xiàn)代制劑，以淫羊藿為主藥，淫羊藿味甘，性溫，歸肝腎經(jīng)，為補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋健骨之要藥[15]，配以續(xù)斷，補(bǔ)骨脂為臣藥，知母，丹參，地黃等為佐使藥，全方共奏滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)和強(qiáng)筋壯骨等功效，臨床主要用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥[16]。本研究結(jié)果顯示，給予老齡大鼠去勢(shì)后骨質(zhì)疏松性骨折大鼠連續(xù)灌胃仙靈骨葆膠囊10周，可明顯增加骨細(xì)胞指數(shù)、破骨細(xì)胞指數(shù)，上調(diào)骨折周圍組織的PDGF、TGF-β和VEGF的相對(duì)表達(dá)，提示仙靈骨葆膠囊有助于促進(jìn)老齡大鼠去勢(shì)后骨質(zhì)疏松性骨折愈合，可能與仙靈骨葆膠囊中的有效成分相關(guān)。李菲等[17]研究認(rèn)為淫羊藿苷對(duì)慢性腦低灌注時(shí)血管新生具有積極的促進(jìn)作用，該作用與上調(diào)受損大腦皮層VEGF信號(hào)通路有關(guān)；李功營(yíng)等[18]對(duì)大鼠圍絕經(jīng)期給予淫羊藿總黃酮，結(jié)果顯示淫羊藿總黃酮能升高VEGF水平，從而延緩大鼠圍絕經(jīng)期進(jìn)程；成魁等[19]認(rèn)為，與去勢(shì)組比，淫羊藿苷組大鼠全身與股骨骨密度、股骨生物力學(xué)性能差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示淫羊藿苷能通過抑制骨吸收而防治骨丟失；寧濤等[20]觀察家兔骨折愈合的促進(jìn)機(jī)制，結(jié)果顯示含有續(xù)斷的復(fù)方續(xù)斷三七提取物可通過上調(diào)家兔外周血的TGF-β水平達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的目的；張波等[21]推測(cè)續(xù)斷對(duì)骨折的治療可能是通過調(diào)控TGF-β基因在骨愈合不同階段的表達(dá)量促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)；魏合偉等[22]研究顯示，運(yùn)用含補(bǔ)骨脂提取物的血清培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行移植，可明顯增強(qiáng)骨痂中PDGF的表達(dá)，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松性骨折的愈合。

綜上所述，仙靈骨葆膠囊可促進(jìn)老齡大鼠去勢(shì)后骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程，可能與仙靈骨葆膠囊提高骨折周圍軟組織PDGF、TGF-β和VEGF的相對(duì)表達(dá)有關(guān)。