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        云南漢族人群HLA-DM基因多態(tài)性與HCV慢性感染的相關(guān)性分析

        2019-06-10 08:23:18陳珺楊瑾劉楠楠劉舒媛李傳印張新文史荔張淑瓊
        關(guān)鍵詞:等位基因多態(tài)性抗原

        陳珺, 楊瑾, 劉楠楠, 劉舒媛, 李傳印, 張新文, 史荔, 張淑瓊**

        (1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650118; 2.昆明市第三人民醫(yī)院, 云南 昆明 650041)

        丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C Virus,HCV)感染引起的病毒性肝炎,主要經(jīng)血液、性及母嬰等途徑傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球每年的HCV感染率約為3%,到2015年感染人數(shù)約為7 100萬,我國每年HCV感染率約為0.7%,感染人數(shù)高達(dá)987.5萬[1],丙型肝炎已成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問題。慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)是HCV感染后,機(jī)體的免疫系統(tǒng)與病毒相互作用的結(jié)果,宿主抗原呈遞相關(guān)基因在HCV的感染和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著重要作用,人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)Ⅱ類分子與HCV感染的相關(guān)性已被多項(xiàng)研究證實(shí)[2-3],且參與HLA Ⅱ類分子抗原呈遞的HLA-DM分子的作用也受到重視。HLA-DM分子可以維持未結(jié)合抗原肽的HLA Ⅱ類分子的穩(wěn)定,并對(duì)外源性抗原肽進(jìn)行加工修飾,促進(jìn)HLA Ⅱ類分子與抗原肽結(jié)合,并延長外源性抗原肽在抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)表面的暴露時(shí)間[4]。HLA-DM基因HLA的Ⅱ類基因區(qū),分為HLA-DMA和HLA-DMB[5]。HLA-DMA和HLA-DMB基因在APC細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成DMα鏈和DMβ鏈,并裝配成異二聚體DM分子,然后轉(zhuǎn)移到內(nèi)體或溶酶體中發(fā)揮其功能[6]。HLA-DM基因與經(jīng)典的HLA Ⅱ類基因類似,也存在多態(tài)性。目前HLA國際命名委員會(huì)確定的HLA-DMA基因和HLA-DMB基因分別有4個(gè)和7個(gè),即DMA *01∶01~01∶04 和 DMB*01∶01~01∶07[7]。HLA-DM基因的多態(tài)性影響著DM分子的結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致抗原呈遞的差異,從而與自身免疫性疾病及感染性疾病的發(fā)生相關(guān)。已有研究報(bào)道,HLA-DM基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)[8],類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)[9],Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)[10]等相關(guān),但與感染性疾病的關(guān)系研究報(bào)道很少。因此本研究擬檢測HCV慢性感染人群中HLA-DM基因的多態(tài)性位點(diǎn),并對(duì)其進(jìn)行分型,初步分析HLA-DM基因多態(tài)性與云南漢族人群HCV慢性感染的相關(guān)性。

        1 對(duì)象與方法

        1.1 樣本收集

        根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)2015年制定的《丙型肝炎防治指南》[11]診治標(biāo)準(zhǔn)及“知情同意”原則,隨機(jī)抽取在云南省某醫(yī)院就診的HCV慢性感染者185名作為病例組。通過臨床和實(shí)驗(yàn)學(xué)檢查,患者血清抗-HCV陽性, HCV RNA≥15 000 U/mL持續(xù)6個(gè)月以上,血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和(或)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (aspartate aminotransferase,AST)升高、肝臟病理學(xué)符合慢性肝炎表現(xiàn),且患者未經(jīng)抗病毒、保肝等治療。排除合并慢性乙型肝炎等其他病毒性肝炎、非酒精性、脂肪性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝炎、失代償性肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、遺傳代謝性肝病、肝臟血管病等其他肝病患者。隨機(jī)抽取同時(shí)期正常健康個(gè)體180名為對(duì)照組,納入標(biāo)準(zhǔn)為受試者血清抗HCV和HCV-RNA陰性,且血清ALT和AST水平正常。所有受試者均為居住于云南地區(qū)的彼此無血緣關(guān)系漢族個(gè)體,病例組男性91例、女性94例,對(duì)照組男性100例、女性80例。采集受試者空腹靜脈血5 mL,用EDTA抗凝,按照Qiagen血基因組DNA提取試劑盒說明書提取外周血基因組DNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 HLA-DM基因分型

        根據(jù)IMGT數(shù)據(jù)庫(https://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/ipd/imgt/hla/allele.cgi)中HLA-DM基因相關(guān)序列,選取10個(gè)SNP位點(diǎn)作為HLA-DMA和HLA-DMB基因的分型判斷標(biāo)準(zhǔn),所選位點(diǎn)均為HLA國際命名委員會(huì)命名HLA-DMA和HLA-DMB基因的特異性位點(diǎn)[7],見表1和表2。分別用引物對(duì)HLA-DMA基因的第3外顯子,HLA-DMB基因的第2外顯子及第3外顯子區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增引物及擴(kuò)增長度見表3。PCR體系包括,模板DNA 10 ng,正向和反向引物各10 pmol,TaKaRa PCR Mix 25 μL(含ExTaq聚合酶,dNTPs),ddH2O 21 μL,反應(yīng)總體系50 μL。PCR條件為98 ℃預(yù)變性5 min,98 ℃變性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸10 s(共30個(gè)循環(huán))。PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序(測序引物同PCR擴(kuò)增引物)以檢測該區(qū)域中的多態(tài)性位點(diǎn)。對(duì)于有2個(gè)以上雜合位點(diǎn)的分型樣本,進(jìn)一步進(jìn)行TA克隆測序,驗(yàn)證其位點(diǎn)多態(tài)性的連鎖情況。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用t檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組中的年齡、性別比例、肝功能指標(biāo)等各項(xiàng)基本信息。使用Pypop[12]軟件進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡(hardy-weinberg equilibrium)檢驗(yàn),計(jì)算位點(diǎn)間的連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD),兩位點(diǎn)間的LD關(guān)系用D′表示,D′>0.8認(rèn)為位點(diǎn)間強(qiáng)連鎖。統(tǒng)計(jì)病例組和對(duì)照組法人基因型頻率及等位基因頻率,構(gòu)建HLA-DMA-DMB基因單倍型。采用卡方檢驗(yàn)(χ2)對(duì)HLA-DM基因的基因型頻率及單倍型在病例組和對(duì)照組之間的分布進(jìn)行分析。單倍型頻率的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中,僅列其中頻率大于0.02的單倍型,P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)基因型頻率的分析結(jié)果進(jìn)行FDR(false discovery rate)校正,調(diào)整P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        表1 HLA-DMA 基因第3外顯子位點(diǎn)Tab.1 SNPs locus of exon 3 of HLA-DMA

        表3 引物序列及片段大小Tab.3 Primer sequences for detecting HLA-DMA, HLA-DMB

        2 結(jié)果

        2.1 研究樣本特征

        病例組和對(duì)照組的年齡,性別比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);病例組的ALT和AST水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05),符合HCV慢性感染的診斷標(biāo)準(zhǔn),見表4。

        表4 兩組研究對(duì)象基本特征Tab.4 Basic characteristics of the subjects

        2.2 HLA-DMA及HLA-DMB各等位基因在病例組和對(duì)照組中的分布

        HLA-DMA及HLA-DMB基因的基因型分布均符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。HLA-DMA,HLA-DMB各等位基因在病例組和對(duì)照組中的分布見表5,經(jīng)FDR校正后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(調(diào)整P>0.05)。在病例組及對(duì)照組中共檢出4種HLA-DMA等位基因DMA*01∶01、DMA*01∶02、DMA*01∶03及DMA*01∶04,5種HLA-DMB等位基因DMB*01∶01、DMB*01∶02、DMB*01∶03、DMB*01∶05及DMB*01∶07。分布頻率最高的HLA-DMA基因的等位基因?yàn)镈MA*01∶01,在病例組和對(duì)照組中頻率分別為0.719和0.672;其次是DMA*01∶02,在病例組和對(duì)照組中頻率分別為0.249和0.306。分布頻率最高的HLA-DMB基因的等位基因?yàn)镈MB*01∶01,在病例組和對(duì)照組中頻率分別為0.489和0.544;其次是DMB*01∶03,在病例組和對(duì)照組中頻率分別為0.311和0.258。

        表5 兩組HLA-DMA及HLA-DMB各等位基因頻率比較Tab.5 Comparison of allele frequencies of HLA-DMA and HLA-DMB genes in case group and control group

        2.3 HLA-DMA -DMB單倍型頻率在病例組和對(duì)照組中的分布

        在病例組和對(duì)照組中,頻率大于0.02的單倍型共有6種,結(jié)果見表6。在病例組及對(duì)照組中,分布頻率最高的HLA-DMA單倍型為DMA*01∶01-DMB*01∶01、在病例組和對(duì)照組中的頻率分別為0.260和0.322,其次為DMA*01∶01-DMB*01∶03、在病例組和對(duì)照組中的頻率分別為0.287和0.197。單倍型DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例組中的頻率顯著高于對(duì)照組(0.287vs 0.197,OR=0.134,95%CI為1.529~2.305,P=0.005),單倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例組中的頻率顯著低于對(duì)照組(0.024 vs 0.056,OR=0.424,95%CI為0.194~0.944,P=0.031)。

        表6 兩組HLA-DMA-DMB單倍型頻率比較Tab.6 Comparison of haplotype frequencies of HLA-DMA-DMB in case group and control group

        3 討論

        病毒的免疫逃逸及宿主的免疫保護(hù)力低下是造成HCV慢性感染的兩個(gè)主要原因,研究表明,HCV慢性感染者的免疫反應(yīng)能力明顯減弱,HCV急性感染后特異性抗體反應(yīng)明顯延遲[13],體內(nèi)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)明顯降低[14]。HLA分子可影響抗原肽的呈遞,影響宿主的抗病毒免疫應(yīng)答,從而影響HCV感染的臨床結(jié)局[2,15]。HLA-DM分子作為HLA-Ⅱ類分子的分子伴侶在抗原呈遞的過程中發(fā)揮重要作用,當(dāng)DM分子缺失時(shí),機(jī)體不能形成穩(wěn)定的MHC-Ⅱ類分子-抗原肽復(fù)合物[16]。HLA-DM基因多態(tài)性導(dǎo)致HLA-DM分子構(gòu)象和功能的差異,從而影響抗原的呈遞效率,因此該基因是疾病易感性研究過程中的重要靶標(biāo)[4]。Huang等[17]的研究表明,HLA-DMA基因的rs1063478 T在HCV慢性感染組中的頻率顯著低于健康對(duì)照組(0.025 vs 0.177,OR=0.160,95%CI為0.08~0.30,P=0.020),顯著降低了HCV感染的風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步研究表明,rs1063478 TT基因型的HCV患者具有較強(qiáng)的病毒持續(xù)應(yīng)答,從而影響聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療HCV的療效[18]。本研究結(jié)果顯示,rs1063478(codon140)在HCV慢性感染組中等位基因T的頻率為0.257,健康對(duì)照組中的頻率為0.292,兩者的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

        目前,DM基因多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián)研究集中于自身免疫性疾病的研究。構(gòu)象分析表明,與DMA*01∶01相比,DMA*01∶03等位基因的氨基酸序列發(fā)生了G155A,R184H突變,這兩個(gè)位點(diǎn)是DM分子與HLA-Ⅱ類分子作用的關(guān)鍵位點(diǎn),其改變影響了HLA-Ⅱ類分子與抗原肽結(jié)合的結(jié)合力,有助于延長抗原肽的暴露時(shí)間,從而增加了自身免疫性疾病的易感性[19]。因此,無論在RA還是T1D的研究中均表明:DMA*01∶03在RA患者中的頻率顯著增高 (0.263 vs 0.042,OR=9.00,95%CI為1.10~73.7,P=0.014);在T1D患者中的頻率也顯著高于對(duì)照(0.500 vs 0.080,P<0.05)[1]。此外,在T1D的關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn),DMA*01∶02的表型頻率在德國患者(0.120 vs 0.289,P<0.01)[20]及中國患者中均顯著降低(0.108 vs 0.420,P<0.001)[19]。DMA*01∶02與DMA*01∶03與T1D的相關(guān)性不同,對(duì)其氨基酸序列分析顯示,DMA*01∶02的140、155、84位氨基酸分別為I、G、R,而DMA*01∶03為V、A、H,提示其氨基酸序列的改變可能是原因之一。在本研究中,DMA*01∶02在病例組的頻率較低(0.249 vs 0.306),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),單倍型統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例組中的頻率顯著低于對(duì)照組(0.024 vs 0.056,OR=0.424,95%CI為0.194~0.944,P=0.031),提示DMA*01∶02-DMB*01∶03可能是HCV慢性感染的保護(hù)性單倍型。

        HLA-DMB基因多態(tài)性的研究中,DMB*01∶01的表型頻率在T1D患者中顯著降低,德國人群[21]中為(0.706 vs 0.978,P<0.05),中國人群[11]中為(0.486 vs 0.736,P<0.05),而DMB*01∶03在患者中顯著增高,表型頻率分別為(0.284 vs 0.045,P<0.001)和(0.429 vs 0.218,P<0.05)。與DMB*01∶01相比,DMB*01∶03等位基因的氨基酸序列僅發(fā)生了I179T突變,而這兩個(gè)等位基因在T1D中的作用卻相反,提示該位點(diǎn)可能是DM分子作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。然而,在RA的關(guān)聯(lián)研究中,DMB*01∶03在法國RA患者中的表型頻率顯著增高(0.183 vs 0.040,P=0.004)[9],但在美國白人RA患者中的研究結(jié)果卻與之相反,DMB*01∶03表型頻率顯著降低(0.202 vs 0.445,P<0.05)[21]。本研究中,DMB*01∶03在病例組中的頻率較高(0.311 vs 0.258),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而單倍型頻率DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例組中的頻率顯著高于對(duì)照組(0.287 vs 0.197,OR=1.634,95%CI為1.159~2.305,P=0.005),提示DMA*01∶01-DMB*01∶03可能是云南漢族人群HCV慢性感染的易感單倍型。

        本研究中,HLA-DMA,DMB分布與Feng等[22]報(bào)道的中國漢族群體研究結(jié)果一致,DMA*01∶01,DMA*01∶02最為常見,等位基因頻率分別為0.694和0.280;同樣,DMB*01∶01,DMB*01∶03在中國漢族群體中最為常見,等位基因頻率分別為0.525和0.316。然而,HLA-DM基因在中國漢族群體中的分布與美國白人,意大利人存在顯著差異,比如 DMB*01∶03位點(diǎn)在中國人群中的等位基因頻率為0.316,顯著高于美國白人(0.196)及意大利人(0.020)[23-25],提示遺傳背景的差異可能導(dǎo)致關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果不同。且本研究的樣本量較少,后續(xù)應(yīng)該擴(kuò)大樣本量對(duì)HLA-DM基因與云南漢族人群HCV慢性感染的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

        綜上,本研究結(jié)果表明,HLA-DMA,DMB等位基因頻率在病例組與對(duì)照組中的分布無顯著差異,但單倍型DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例組中的頻率高于對(duì)照組,單倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例組中的頻率顯著低于對(duì)照組,提示HLA-DM基因單倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03,DMA*01∶02-DMB*01∶03可能與云南漢族人群中HCV的慢性感染相關(guān)。

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