陳珺， 楊瑾， 劉楠楠， 劉舒媛， 李傳印， 張新文， 史荔， 張淑瓊**

(1.中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室， 云南 昆明 650118; 2.昆明市第三人民醫(yī)院， 云南 昆明 650041)

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C Virus，HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要經(jīng)血液、性及母嬰等途徑傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年的HCV感染率約為3%，到2015年感染人數(shù)約為7 100萬，我國每年HCV感染率約為0.7%，感染人數(shù)高達987.5萬[1]，丙型肝炎已成為嚴重的社會和公共衛(wèi)生問題。慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是HCV感染后，機體的免疫系統(tǒng)與病毒相互作用的結(jié)果，宿主抗原呈遞相關(guān)基因在HCV的感染和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著重要作用，人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)Ⅱ類分子與HCV感染的相關(guān)性已被多項研究證實[2-3]，且參與HLA Ⅱ類分子抗原呈遞的HLA-DM分子的作用也受到重視。HLA-DM分子可以維持未結(jié)合抗原肽的HLA Ⅱ類分子的穩(wěn)定，并對外源性抗原肽進行加工修飾，促進HLA Ⅱ類分子與抗原肽結(jié)合，并延長外源性抗原肽在抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)表面的暴露時間[4]。HLA-DM基因HLA的Ⅱ類基因區(qū)，分為HLA-DMA和HLA-DMB[5]。HLA-DMA和HLA-DMB基因在APC細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成DMα鏈和DMβ鏈，并裝配成異二聚體DM分子，然后轉(zhuǎn)移到內(nèi)體或溶酶體中發(fā)揮其功能[6]。HLA-DM基因與經(jīng)典的HLA Ⅱ類基因類似，也存在多態(tài)性。目前HLA國際命名委員會確定的HLA-DMA基因和HLA-DMB基因分別有4個和7個，即DMA *01∶01～01∶04 和 DMB*01∶01～01∶07[7]。HLA-DM基因的多態(tài)性影響著DM分子的結(jié)構(gòu)和功能，導致抗原呈遞的差異，從而與自身免疫性疾病及感染性疾病的發(fā)生相關(guān)。已有研究報道，HLA-DM基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)[8]，類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)[9]，Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes，T1D)[10]等相關(guān)，但與感染性疾病的關(guān)系研究報道很少。因此本研究擬檢測HCV慢性感染人群中HLA-DM基因的多態(tài)性位點，并對其進行分型，初步分析HLA-DM基因多態(tài)性與云南漢族人群HCV慢性感染的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 樣本收集

根據(jù)中華醫(yī)學會肝病學分會和中華醫(yī)學會感染病學分會2015年制定的《丙型肝炎防治指南》[11]診治標準及“知情同意”原則，隨機抽取在云南省某醫(yī)院就診的HCV慢性感染者185名作為病例組。通過臨床和實驗學檢查，患者血清抗-HCV陽性， HCV RNA≥15 000 U/mL持續(xù)6個月以上，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和(或)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (aspartate aminotransferase，AST)升高、肝臟病理學符合慢性肝炎表現(xiàn)，且患者未經(jīng)抗病毒、保肝等治療。排除合并慢性乙型肝炎等其他病毒性肝炎、非酒精性、脂肪性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝炎、失代償性肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、遺傳代謝性肝病、肝臟血管病等其他肝病患者。隨機抽取同時期正常健康個體180名為對照組，納入標準為受試者血清抗HCV和HCV-RNA陰性，且血清ALT和AST水平正常。所有受試者均為居住于云南地區(qū)的彼此無血緣關(guān)系漢族個體，病例組男性91例、女性94例，對照組男性100例、女性80例。采集受試者空腹靜脈血5 mL，用EDTA抗凝，按照Qiagen血基因組DNA提取試劑盒說明書提取外周血基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 HLA-DM基因分型

根據(jù)IMGT數(shù)據(jù)庫(https://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/ipd/imgt/hla/allele.cgi)中HLA-DM基因相關(guān)序列，選取10個SNP位點作為HLA-DMA和HLA-DMB基因的分型判斷標準，所選位點均為HLA國際命名委員會命名HLA-DMA和HLA-DMB基因的特異性位點[7]，見表1和表2。分別用引物對HLA-DMA基因的第3外顯子，HLA-DMB基因的第2外顯子及第3外顯子區(qū)域進行PCR擴增，擴增引物及擴增長度見表3。PCR體系包括，模板DNA 10 ng，正向和反向引物各10 pmol，TaKaRa PCR Mix 25 μL(含ExTaq聚合酶，dNTPs)，ddH2O 21 μL，反應(yīng)總體系50 μL。PCR條件為98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s(共30個循環(huán))。PCR產(chǎn)物進行Sanger測序(測序引物同PCR擴增引物)以檢測該區(qū)域中的多態(tài)性位點。對于有2個以上雜合位點的分型樣本，進一步進行TA克隆測序，驗證其位點多態(tài)性的連鎖情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用t檢驗比較病例組和對照組中的年齡、性別比例、肝功能指標等各項基本信息。使用Pypop[12]軟件進行哈迪-溫伯格平衡(hardy-weinberg equilibrium)檢驗，計算位點間的連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)，兩位點間的LD關(guān)系用D′表示，D′>0.8認為位點間強連鎖。統(tǒng)計病例組和對照組法人基因型頻率及等位基因頻率，構(gòu)建HLA-DMA-DMB基因單倍型。采用卡方檢驗(χ2)對HLA-DM基因的基因型頻率及單倍型在病例組和對照組之間的分布進行分析。單倍型頻率的統(tǒng)計分析結(jié)果中，僅列其中頻率大于0.02的單倍型，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。對基因型頻率的分析結(jié)果進行FDR(false discovery rate)校正，調(diào)整P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

表1 HLA-DMA 基因第3外顯子位點Tab.1 SNPs locus of exon 3 of HLA-DMA

表3 引物序列及片段大小Tab.3 Primer sequences for detecting HLA-DMA, HLA-DMB

2 結(jié)果

2.1 研究樣本特征

病例組和對照組的年齡，性別比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；病例組的ALT和AST水平顯著高于對照組(P<0.05)，符合HCV慢性感染的診斷標準，見表4。

表4 兩組研究對象基本特征Tab.4 Basic characteristics of the subjects

2.2 HLA-DMA及HLA-DMB各等位基因在病例組和對照組中的分布

HLA-DMA及HLA-DMB基因的基因型分布均符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。HLA-DMA，HLA-DMB各等位基因在病例組和對照組中的分布見表5，經(jīng)FDR校正后差異無統(tǒng)計學意義(調(diào)整P>0.05)。在病例組及對照組中共檢出4種HLA-DMA等位基因DMA*01∶01、DMA*01∶02、DMA*01∶03及DMA*01∶04，5種HLA-DMB等位基因DMB*01∶01、DMB*01∶02、DMB*01∶03、DMB*01∶05及DMB*01∶07。分布頻率最高的HLA-DMA基因的等位基因為DMA*01∶01，在病例組和對照組中頻率分別為0.719和0.672；其次是DMA*01∶02，在病例組和對照組中頻率分別為0.249和0.306。分布頻率最高的HLA-DMB基因的等位基因為DMB*01∶01，在病例組和對照組中頻率分別為0.489和0.544；其次是DMB*01∶03，在病例組和對照組中頻率分別為0.311和0.258。

表5 兩組HLA-DMA及HLA-DMB各等位基因頻率比較Tab.5 Comparison of allele frequencies of HLA-DMA and HLA-DMB genes in case group and control group

2.3 HLA-DMA -DMB單倍型頻率在病例組和對照組中的分布

在病例組和對照組中，頻率大于0.02的單倍型共有6種，結(jié)果見表6。在病例組及對照組中，分布頻率最高的HLA-DMA單倍型為DMA*01∶01-DMB*01∶01、在病例組和對照組中的頻率分別為0.260和0.322，其次為DMA*01∶01-DMB*01∶03、在病例組和對照組中的頻率分別為0.287和0.197。單倍型DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例組中的頻率顯著高于對照組(0.287vs 0.197，OR=0.134，95%CI為1.529～2.305，P=0.005)，單倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例組中的頻率顯著低于對照組(0.024 vs 0.056，OR=0.424，95%CI為0.194～0.944，P=0.031)。

表6 兩組HLA-DMA-DMB單倍型頻率比較Tab.6 Comparison of haplotype frequencies of HLA-DMA-DMB in case group and control group

3 討論

病毒的免疫逃逸及宿主的免疫保護力低下是造成HCV慢性感染的兩個主要原因，研究表明，HCV慢性感染者的免疫反應(yīng)能力明顯減弱，HCV急性感染后特異性抗體反應(yīng)明顯延遲[13]，體內(nèi)CD4+T細胞和CD8+T細胞反應(yīng)明顯降低[14]。HLA分子可影響抗原肽的呈遞，影響宿主的抗病毒免疫應(yīng)答，從而影響HCV感染的臨床結(jié)局[2,15]。HLA-DM分子作為HLA-Ⅱ類分子的分子伴侶在抗原呈遞的過程中發(fā)揮重要作用，當DM分子缺失時，機體不能形成穩(wěn)定的MHC-Ⅱ類分子-抗原肽復(fù)合物[16]。HLA-DM基因多態(tài)性導致HLA-DM分子構(gòu)象和功能的差異，從而影響抗原的呈遞效率，因此該基因是疾病易感性研究過程中的重要靶標[4]。Huang等[17]的研究表明，HLA-DMA基因的rs1063478 T在HCV慢性感染組中的頻率顯著低于健康對照組(0.025 vs 0.177，OR=0.160，95%CI為0.08～0.30，P=0.020)，顯著降低了HCV感染的風險。進一步研究表明，rs1063478 TT基因型的HCV患者具有較強的病毒持續(xù)應(yīng)答，從而影響聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療HCV的療效[18]。本研究結(jié)果顯示，rs1063478(codon140)在HCV慢性感染組中等位基因T的頻率為0.257，健康對照組中的頻率為0.292，兩者的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

目前，DM基因多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián)研究集中于自身免疫性疾病的研究。構(gòu)象分析表明，與DMA*01∶01相比，DMA*01∶03等位基因的氨基酸序列發(fā)生了G155A，R184H突變，這兩個位點是DM分子與HLA-Ⅱ類分子作用的關(guān)鍵位點，其改變影響了HLA-Ⅱ類分子與抗原肽結(jié)合的結(jié)合力，有助于延長抗原肽的暴露時間，從而增加了自身免疫性疾病的易感性[19]。因此，無論在RA還是T1D的研究中均表明：DMA*01∶03在RA患者中的頻率顯著增高 (0.263 vs 0.042，OR=9.00，95%CI為1.10～73.7，P=0.014)；在T1D患者中的頻率也顯著高于對照(0.500 vs 0.080，P<0.05)[1]。此外，在T1D的關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)，DMA*01∶02的表型頻率在德國患者(0.120 vs 0.289，P<0.01)[20]及中國患者中均顯著降低(0.108 vs 0.420，P<0.001)[19]。DMA*01∶02與DMA*01∶03與T1D的相關(guān)性不同，對其氨基酸序列分析顯示，DMA*01∶02的140、155、84位氨基酸分別為I、G、R，而DMA*01∶03為V、A、H，提示其氨基酸序列的改變可能是原因之一。在本研究中，DMA*01∶02在病例組的頻率較低(0.249 vs 0.306)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，單倍型統(tǒng)計結(jié)果顯示DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例組中的頻率顯著低于對照組(0.024 vs 0.056，OR=0.424，95%CI為0.194～0.944，P=0.031)，提示DMA*01∶02-DMB*01∶03可能是HCV慢性感染的保護性單倍型。

HLA-DMB基因多態(tài)性的研究中，DMB*01∶01的表型頻率在T1D患者中顯著降低，德國人群[21]中為(0.706 vs 0.978，P<0.05)，中國人群[11]中為(0.486 vs 0.736，P<0.05)，而DMB*01∶03在患者中顯著增高，表型頻率分別為(0.284 vs 0.045，P<0.001)和(0.429 vs 0.218，P<0.05)。與DMB*01∶01相比，DMB*01∶03等位基因的氨基酸序列僅發(fā)生了I179T突變，而這兩個等位基因在T1D中的作用卻相反，提示該位點可能是DM分子作用的關(guān)鍵位點。然而，在RA的關(guān)聯(lián)研究中，DMB*01∶03在法國RA患者中的表型頻率顯著增高(0.183 vs 0.040，P=0.004)[9]，但在美國白人RA患者中的研究結(jié)果卻與之相反，DMB*01∶03表型頻率顯著降低(0.202 vs 0.445，P<0.05)[21]。本研究中，DMB*01∶03在病例組中的頻率較高(0.311 vs 0.258)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而單倍型頻率DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例組中的頻率顯著高于對照組(0.287 vs 0.197，OR=1.634，95%CI為1.159～2.305，P=0.005)，提示DMA*01∶01-DMB*01∶03可能是云南漢族人群HCV慢性感染的易感單倍型。

本研究中，HLA-DMA，DMB分布與Feng等[22]報道的中國漢族群體研究結(jié)果一致，DMA*01∶01，DMA*01∶02最為常見，等位基因頻率分別為0.694和0.280；同樣，DMB*01∶01，DMB*01∶03在中國漢族群體中最為常見，等位基因頻率分別為0.525和0.316。然而，HLA-DM基因在中國漢族群體中的分布與美國白人，意大利人存在顯著差異，比如 DMB*01∶03位點在中國人群中的等位基因頻率為0.316，顯著高于美國白人(0.196)及意大利人(0.020)[23-25]，提示遺傳背景的差異可能導致關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果不同。且本研究的樣本量較少，后續(xù)應(yīng)該擴大樣本量對HLA-DM基因與云南漢族人群HCV慢性感染的關(guān)系進行進一步的驗證。

綜上，本研究結(jié)果表明，HLA-DMA，DMB等位基因頻率在病例組與對照組中的分布無顯著差異，但單倍型DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例組中的頻率高于對照組，單倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例組中的頻率顯著低于對照組，提示HLA-DM基因單倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03，DMA*01∶02-DMB*01∶03可能與云南漢族人群中HCV的慢性感染相關(guān)。