向潔， 曾曉曉， 曹坤， 董陽婷， 徐毅， 冉龍艷， 鄧婕， 官志忠,**

(1．貴州醫(yī)科大學(xué)附院 病理科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004)

阿爾茲海默病(alzheimer’s disease,AD)，又稱老年性癡呆，在全球的發(fā)病率日益增加，但由于AD復(fù)雜的發(fā)病因素與分子機(jī)制，到目前為止，所有治療AD的藥物僅能在一定程度上改善患者癥狀，但不能改變患者的發(fā)病進(jìn)程[1-2]。AD的主要神經(jīng)病理學(xué)特征為β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)形成的老年斑及tau蛋白磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)元纖維纏結(jié)[3-4]，Aβ來源于β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)，由β及γ分泌酶進(jìn)行分解而來[5]。當(dāng)Aβ的產(chǎn)生和降解處于失衡狀態(tài)時(shí)，過量的Aβ在人腦中堆積[6]，而Aβ的異常沉積對神經(jīng)元的毒性作用在AD發(fā)病中具有重要影響[7-8]。鋰被發(fā)現(xiàn)用于臨床研究及治療已超過60年，特別是在治療躁狂發(fā)作、雙相障礙等精神疾病中被廣泛應(yīng)用、且效果良好[9-10]。近年來，針對鋰治療作用的研究越來越多，特別在神經(jīng)疾病方向研究中也有了新的突破?，F(xiàn)在已經(jīng)肯定鋰作為糖原合成激酶-3β(glycogen synthetic kinase-3β，GSK3β)的經(jīng)典抑制劑，對GSK3β活性的調(diào)節(jié)具有重要作用[11]，對蛋白磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)有顯著的減輕作用[12-13]。盡管鋰在AD等神經(jīng)退行性疾病防治中的潛在用途被眾人關(guān)注，但其對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用機(jī)制研究報(bào)道較少。本研究以APP/突變型人早老素1(PS1)雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為類AD動物模型，以野生型小鼠作為對照，采用氯化鋰(lithium chloride，LiCl)灌胃小鼠2個(gè)月，觀察LiCl是否能降低小鼠腦組織中的Aβ含量，觀察小鼠腦組織中老年斑含量，分析LiCl是否能減少Aβ對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑

實(shí)驗(yàn)動物為上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司提供的20只，C57BL/6J雌性野生型小鼠5只，B6.Cg-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax種鼠，體質(zhì)量均為20～30 g，生產(chǎn)許可證編號為SCXK(滬)2014-0002。主要試劑：LiCl(美國 Sigma公司)，小鼠Aβ42ELISA 試劑盒(美國 Invitrogen公司)，ABC免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒、SG顯色試劑盒、中性樹膠封片劑(美國 Vectorlabs公司)，2×PCRTagMix(日本 TaKaRa公司)，DL2000DNA Marker(北京天根生物公司)， Anti-Aβ6E10(美國 Govance公司)。

1.2 方法

1.2.1AD動物模型的制備 5只4月齡B6.Cg-Tg(APPswe，PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax種鼠與20只雌性野生型C57BL/6J小鼠(20～30 g)在SPF級的動物房中以30%～50%濕度、22～25 ℃溫度條件下適應(yīng)喂養(yǎng)1周，以1∶4的比例將種鼠與雌鼠合籠交配，仔鼠出生第10天時(shí)進(jìn)行鑒定，分選出野生型及APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠；喂養(yǎng)至1月齡時(shí)，進(jìn)行雌雄分籠，飼養(yǎng)于光照與黑暗各12 h的恒溫獨(dú)立通風(fēng)籠內(nèi)，每籠5只，自由攝食及飲水。將小鼠分為4組(每組6只)，分別為野生型 (wild type，WT組) 組、WT+Li組、APP/PS1組及APP/PS1+Li組，各組小鼠均自由攝食及飲水，WT組及APP/PS1組小鼠在4月或8月齡時(shí)，對其進(jìn)行生理鹽水灌胃處理，1次/d，為期2個(gè)月；WT+LiCl組及APP/PS1+LiCl組小鼠在4月或8月齡時(shí)，用LiCl(100 mg/kg)灌胃處理，1次/d，為期2個(gè)月[14]。

1.2.2小鼠DNA提取 剪取1周齡以上小鼠0.2～0.4 cm尾端，將鼠尾放入已編號的1.5 mLEppendorf(Epp)管中；每管加入裂解液0.5 mL及蛋白酶K貯存液0.05 mL，混勻后放入56 ℃水浴箱中過夜；以12 000 r/min離心10 min，取上清入新的1.5 mL Epp管中，加入無水乙醇1 mL，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加70%乙醇1 mL，12 000 r/min離心10 min，棄上清，倒扣風(fēng)干15 min，加ddH2O 200 μL輕輕吹打使之完全溶解；在室溫中放置到DNA完全溶解后定量，直接進(jìn)行PCR處理。

1.2.3APP及PS1基因檢測 采用PCR法，按照表1所示APP及PS1基因的引物序列合成相應(yīng)引物；取出已制備好的小鼠模板DNA，按照ddH2O 8.5 μL、2×PremixTag 12.5 μL、APP上游0.5 μL、APP下游0.5 μL、PS1上游0.5 μL PS1下游0.5 μL、GenomicDNA 2 μL配制總反應(yīng)體系(共25 μL)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30個(gè)循壞，72 ℃最后延伸5 min。同時(shí)制備1.5%瓊脂糖凝膠，待PCR產(chǎn)物擴(kuò)增完成后，進(jìn)行凝膠電泳，于凝膠成像分析系統(tǒng)Gene Sys進(jìn)行曝光分析。

表1 APP及PS1引物序列Tab.1 Primer sequences used for genotyping mouse APP and PS1 genes

1.2.4小鼠腦組織中老年斑含量 采用免疫組織化學(xué)法檢測，取小鼠右側(cè)大腦半球正矢狀面腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片(4 μm)。老年斑檢測：常規(guī)脫蠟(二甲苯10 min×3次)、酒精水化(100%、95%、75%、50%、雙蒸水，各10 min)，檸檬酸鹽修復(fù)(pH 6.0，高壓鍋修復(fù)2.5 min)，3%雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶(10 min)，1×PBST洗滌切片(5 min×3次)，10%馬血清封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜(Anti-Aβ6E10 1∶50)，l×PBST洗滌(5 min×3次)，按照ABC免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行二抗孵育(1∶50)，l×PBST洗滌(5 min×3次)，顯微鏡下DAB顯色(陽性為棕色)，蒸餾水終止顯色，酒精上行脫水(75%、95%、100%，各10 min)、二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。

1.2.5小鼠腦組織中不可溶性Aβ含量測定 按照小鼠Aβ42ELISA 試劑盒說明書配置所需試劑。取0.1 g腦組織，用配置好的裂解液進(jìn)行組織勻漿，制備樣品。確定8連管數(shù)量，向空白孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100 μL，作為空白對照；向孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品或?qū)φ諛悠?00 μL，混合均勻，室溫孵2 h，吸出液體，清洗液洗4次；每孔加入Aβ42檢測抗體100 μL，除空白對照孔外，液體為藍(lán)色，輕輕敲打板側(cè)面進(jìn)行混合；室溫孵育1 h，吸出液體，清洗液洗4次；加入抗兔IgG-HRP工作液(二抗)100 μL，空白對照孔不加；室溫孵育30 min,吸出液體，清洗液洗4次；每孔加入穩(wěn)定著色劑100 μL，液體開始變藍(lán)，每孔中加入StopSolution液100 μL，輕輕敲打板側(cè)面，24 h內(nèi)讀板；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀取未知樣品和對照Aβ42濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因鑒定

如圖1所示，以新生小鼠DNA為模板擴(kuò)增，可見在 9只小鼠中有 3 只小鼠(1、4、7)基因組 DNA 擴(kuò)增出400 bp及600 bp大小的目的片段，與所設(shè)計(jì)的APP及PS1基因擴(kuò)增片段大小一致。證實(shí)該小鼠為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠。

注：M 為DL2000DNAMarker，1、4、7號是APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，其余為野生型小鼠圖1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因鑒定Fig.1 The genotype pattern of the APP gene and PS1 gene in APP/PS1 double transgenic mice

2.2 小鼠腦組織老年斑數(shù)量

如圖2所示，與WT組小鼠相比， APP/PS1組小鼠腦組織有不同程度的老年斑生成，兩組數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，10月齡小鼠更明顯；而對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠給予LiCl灌胃處理后，其腦組織內(nèi)老年斑數(shù)量較未經(jīng)LiCl處理的同齡APP/PS1小鼠顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；WT+Li組小鼠與WT組小鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

(1)與WT組比較，P<0.05；(2)與APP/PS1組比較，P<0.05圖2 6月齡和10月齡小鼠腦組織中老年斑數(shù)量(DAB染色)Fig.2 Senile plaques in the brains of Wt mice and APP/PS1 mice at 6 and 10 months old

2.3 小鼠腦組織內(nèi)不可溶性 Aβ含量

由圖3所示，與WT組小鼠比較， APP/PS1組小鼠腦組織內(nèi)不可溶性Aβ含量顯著增加(P<0.05)，10月齡小鼠更明顯；而對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠給予LiCl灌胃處理后，其腦組織內(nèi)不可溶性Aβ含量較未經(jīng)LiCl處理的同齡APP/PS1小鼠顯著減少(P<0.05)；WT+Li組小鼠與WT組小鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

(1)與WT組比較，P<0.05；(2)與APP/PS1組比較，P<0.05圖3 6月齡及10月齡小鼠腦組織內(nèi)不可溶性Aβ含量(ELISA)Fig.3 The content of Aβ42 of 6 and 10 months-old mouse brains

3 討論

到目前為止，有關(guān)AD發(fā)病機(jī)制方面報(bào)道得最多是淀粉樣肽瀑布假說，該學(xué)說主要指出了腦內(nèi)Aβ產(chǎn)生和清除的不平衡導(dǎo)致了Aβ增多，結(jié)果引起腦組織神經(jīng)元退行性變而發(fā)生AD[15-16]。Aβ可通過干擾鈣穩(wěn)態(tài)使線粒體功能障礙，誘導(dǎo)皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元變性，并可直接損傷突觸可塑性及記憶功能[17]，在 AD 發(fā)病機(jī)制中起著核心作用[18]。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)嵌合小鼠/人淀粉樣前體蛋白(Mo/HuAPP695swe)和PS1，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元內(nèi)這2種突變都與早發(fā)性AD有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，5月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織內(nèi)即可出現(xiàn)明顯的淀粉樣斑塊，且年齡越大的雙轉(zhuǎn)基因小鼠其腦中β淀粉樣蛋白含量及老年斑沉積越多[19]。本實(shí)驗(yàn)選用4月齡小鼠開始灌胃處理，探究LiCl是否能夠預(yù)防雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中β淀粉樣蛋白的過多生成。另外，對8月齡雙轉(zhuǎn)基因小鼠灌胃處理2個(gè)月，研究LiCl在β淀粉樣蛋白產(chǎn)生過多、老年斑生成后，能否減少其含量，逆轉(zhuǎn)癡呆模型鼠的病理學(xué)改變。

鋰作為一種情緒穩(wěn)定劑，自被發(fā)現(xiàn)以來一直被用于治療精神疾病，對其改善神經(jīng)系統(tǒng)功能，對AD的潛在治療作用等方面已經(jīng)進(jìn)行了研究[20]。有報(bào)道指出，鋰作為GSK-3β有效抑制劑，通過調(diào)控GSK-3β下游多條信號通路，發(fā)揮其抗氧化、抗炎和維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的特性[21]。同時(shí)LiCl對突觸萎縮可以有良好的治療作用，能逆轉(zhuǎn)岡田酸造成的突觸損害[22]。Cisternas等[23]指出，鋰通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路改善AD患者糖代謝紊亂，從而發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶功能的有益作用。鋰作為一種多方向治療藥物，在對抗復(fù)雜的癡呆分子病理學(xué)方面具有優(yōu)勢。在本研究結(jié)果顯示，與WT型小鼠相比，6月齡及10月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中有較多數(shù)量的老年斑，不可溶性Aβ含量顯著增加。與此同時(shí)，本研究還分別對4月及8月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠給予LiCl灌胃處理2個(gè)月，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中老年斑數(shù)量及不可溶性Aβ含量與未經(jīng)LiCl處理的同齡APP/PS1小鼠比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示LiCl能預(yù)防及逆轉(zhuǎn)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中Aβ含量的增多及老年斑的生成，可能降低Aβ在AD發(fā)病過程中的毒性作用。Pan等[24]最新研究也發(fā)現(xiàn)LiCl處理使APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦微血管LRP1蛋白表達(dá)增加及并促進(jìn)腦脊液循環(huán)整體流通，從而能促進(jìn)腦組織中可溶性Aβ的清除。

綜上所述，LiCl處理可減少APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織Aβ含量，可能是通過預(yù)防其產(chǎn)生或者加速其清除完成的，對AD的藥物治療有一定的參考意義。