史新竹，申紅梅

（1.沈陽醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院流行病學教研室，遼寧沈陽110034；2.哈爾濱醫(yī)科大學中國疾病預防控制中心地方病控制中心）

哺乳期婦女適宜的碘營養(yǎng)，是下一代在胎兒期和出生后早期腦發(fā)育的重要保障。哺乳期婦女碘營養(yǎng)不足，勢必會給下一代帶來因碘缺乏所致的各種危害。鈉碘同向轉運體（sodium iodide symporter，NIS）是甲狀腺攝取碘的生理基礎，介導碘轉運至甲狀腺濾泡細胞內合成甲狀腺激素。NIS也是哺乳期乳腺重要的攝碘蛋白，但僅存在于妊娠期和哺乳期的乳腺中［1］。甲狀腺NIS活性受到促甲狀腺激素（TSH）、碘、雌激素等的影響。TSH主要調控甲狀腺的功能和碘的攝取，是影響NIS表達和定位的主要因素，對NIS基因的表達起到促進作用［2］。目前公認的甲狀腺NIS調控信號通路是環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA），主要受到TSH調節(jié)，屬于正向調節(jié)通路［3］。在一定程度上TSH的磷酸化模式依賴于PKA調節(jié)完成［4］。乳腺是對激素非常敏感的器官，內分泌功能改變和腺體疾病均能對其產生直接影響。本課題組前期觀察不同碘水平下哺乳期乳腺攝碘調節(jié)因素時發(fā)現(xiàn)，哺乳期乳腺NIS水平的調節(jié)因素與甲狀腺相似［5］。為探討TSH對哺乳期乳腺NIS表達中發(fā)揮的作用，本研究在原代哺乳期乳腺細胞中觀察了TSH對NIS表達的調節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 TSH（美國Sigma公司），實時熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），PKA抑制劑（H-89）（美國Cayman Chemical公司），促甲狀腺激素受體（TSHR）抗體、NIS抗體（美國ABBIOTEC公司）、β-actin單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 儀器與設備 實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），Odyssey紅外線成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），凝膠電泳儀（美國Pharmacia Biotech公司），酶標儀（上海天呈科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)原代哺乳期乳腺細胞 BALB/c小鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司）喂飼普通飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司)，飲用蒸餾水。當雌性小鼠體重達到20 g時，挑選皮毛光滑無病雌性小鼠與成熟雄性小鼠按5∶1比例合籠交配。受孕后分籠觀察其生產情況。

提取哺乳期BALB/c小鼠乳腺組織于DMEM/F12培養(yǎng)基中洗滌，制備組織勻漿。膠原酶消化后，置于37℃震蕩孵育箱內消化15～20 min，120 r/min。研磨過濾未消化完全的組織，加DMEM/F12培養(yǎng)基于濾液中終止消化，制成細胞懸液。調整細胞密度，置于培養(yǎng)瓶中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h。待細胞貼壁生長并鋪滿瓶底90%后傳代。

1.3.2 實驗分組 第二代細胞分組干預。將TSH用去離子水稀釋配制成不同劑量。TSH不同劑量組：分別用不同劑量 TSH（0、0.01、0.03、0.05 μg/ml）干預細胞 24 h；沉默分組：50 nmol/L TSHR siRNA組、陰性對照組和平行空白組；PKA抑制組：H-89抑制PKA 30 min后加入0.03 μg/ml TSH干預24 h，同步設置0.03 μg/ml TSH干預組和空白組。

1.3.3 實時熒光定量PCR法檢測原代哺乳期乳腺細胞NIS mRNA的表達 無血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h，PBS洗滌6孔板中細胞3次，預冷Trizol裂解細胞3 min；三氯甲烷分離裂解細胞，移液器吸取中間清亮水相部分，加入與吸取液體等量異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，留取沉淀；預冷75%乙醇洗滌RNA并測定RNA濃度；配制逆轉錄反應體系，在PCR梯度儀合成cDNA，實時熒光定量PCR儀實現(xiàn)擴增反應。

反應條件為95℃預變性30 s；95℃變性5 s；60℃（NIS）／58℃（β-actin）退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)；72℃終延伸10 min。引物見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.4 Western blot法檢測NIS蛋白的表達 細胞加入裂解液10 min，充分刮取蛋白，12 000 r/min離心20 min，收集上清蛋白，測蛋白濃度。電泳2 h，PVDF轉膜50 min，封閉液封閉1 h。分別用兔抗鼠NIS單抗（1∶400）和單抗β-actin（1∶1 000），4℃過夜。DAB顯色，GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)照相觀察。Gelpro軟件比較目的條帶相對灰度值。

1.3.5 TSHR基因沉默 使用優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h，lipo2000用無血清的優(yōu)化培養(yǎng)基稀釋，孵育5 min后與siRNA混和，室溫孵育20 min，形成siRNA-lipo2000混和物。將siRNA-lipo2000混合液加入細胞，混和。置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，5 h后換成正常優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。多個總體均數(shù)差異比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 不同劑量的TSH對原代哺乳期乳腺細胞NIS mRNA和蛋白表達的影響 4組NIS mRNA的表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（F=6.51，P＜0.05），0.05 μg/ml TSH組的NIS mRNA表達量最高。4組NIS蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2、圖1。

表2 不同劑量TSH組NIS mRNA的表達水平比較（±s）

表2 不同劑量TSH組NIS mRNA的表達水平比較（±s）

注：與0.05 μg/ml TSH組比較，1）P＜0.05

F P TSH（μg/ml）0.05 0.03 0.01 0 n5 5 5 5 NIS mRNA 2.09±0.89 1.22±0.261）0.86±0.271）0.96±0.061）6.510.00

圖1 TSH不同劑量組NIS蛋白表達

2.2 TSHR siRNA沉默TSHR基因對NIS蛋白表達的影響 TSHR siRNA組、陰性對照組和空白組的NIS蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 沉默TSHR基因后NIS蛋白的表達

2.3 抑制PKA對哺乳期乳腺細胞NIS蛋白表達的影響 PKA抑制組、TSH組和空白組的NIS蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（F=8.45，P＜0.01），PKA抑制組NIS蛋白表達水平明顯低于TSH組和空白組（P＜0.05）。見表3和圖3。

表3 抑制PKA后NIS蛋白表達（±s）

表3 抑制PKA后NIS蛋白表達（±s）

注：與PKA抑制組比較，1）P＜0.05

組別PKA抑制組TSH組空白組n3 3 3 NIS蛋白0.29±0.05 0.41±0.021）0.39±0.011）F P 8.450.01

圖3 抑制PKA后NIS蛋白的表達

3 討論

NIS主要位于甲狀腺細胞基底外側膜上，介導碘的主動轉運，生產足夠的甲狀腺激素。有研究證實NIS在多個組織中表達，但僅在甲狀腺和哺乳期乳腺中處于高表達狀態(tài)［6］，這與哺乳期乳腺需碘量增大密切相關。

乳腺哺乳期攝碘量大幅增加，NIS在哺乳期乳腺細胞基底外側膜表達，從血液中吸取碘化物到乳汁中，高效積累碘化物。甲狀腺攝碘受到TSH嚴格調控，刺激NIS半衰期延長。本研究應用不同劑量TSH作用于哺乳期乳腺細胞，觀察到高濃度TSH對哺乳期乳腺細胞NIS的表達有一定調節(jié)作用，低濃度TSH作用不明顯。本研究還對與TSH結果的關鍵蛋白TSHR進行沉默，但未觀察到細胞NIS水平的顯著變化。TSHR屬于G蛋白偶聯(lián)受體，一旦與配體TSH結合，即起到連接細胞內外環(huán)境，向細胞內部傳遞TSH所攜帶信息的作用。有研究顯示在哺乳期乳腺細胞中存在TSHR表達［7］，提示乳腺中NIS很可能受到TSH影響。此次TSHR沉默后未觀察到NIS水平變化，其原因可能是沉默過程中產生了RNA干擾的脫靶現(xiàn)象［8］，當siRNA與靶位點序列完全互補配對時，復合體直接切割靶標mRNA，導致其被快速降解，其他可能原因需進一步探討。

本研究抑制PKA活性后，抑制組NIS蛋白表達量顯著低于正常對照組，提示PKA作為重要的蛋白激酶在哺乳期乳腺細胞NIS調節(jié)過程中，起到上調NIS表達的作用。PKA是一種普遍存在于動物體內的蛋白激酶，且蛋白酶抑制劑可與PKA催化亞基結合抑制PKA活性。甲狀腺中TSH主要通過cAMP/PKA信號通路調控細胞增殖、分化及NIS表達，PKA刺激NUE（NIS上游增強子），改變NIS表達［1］。

綜上所述，高濃度TSH對小鼠哺乳期乳腺細胞NIS表達具有一定調節(jié)作用；蛋白激酶PKA可上調NIS表達。