高瑩，呂蕾

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 無(wú)錫 214000）

科萊毒素的發(fā)現(xiàn)成為腫瘤免疫的萌芽，免疫系統(tǒng)與腫瘤微環(huán)境的相互影響逐漸被人們所認(rèn)識(shí)［1］。T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白域分子（T cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecules，Tim）作為免疫系統(tǒng)中一種新的基因家族，該家族可在鼠類和人類基因上表達(dá)，在人類，表達(dá)于染色體5q33.2上，主要有3個(gè)成員，即Tim-1、Tim-3和Tim-4。Tim-1選擇性表達(dá)于活化的Th2細(xì)胞；Tim-3選擇性表達(dá)于活化的Th1、Th17細(xì)胞，在免疫調(diào)控中起負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能；Tim-4選擇性表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞中的樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是Tim-1的受體，與Tim-1相互作用，參與腫瘤、過(guò)敏性疾病、自身免疫性疾病等疾病的免疫過(guò)程［2-3］。有研究發(fā)現(xiàn)，Tim-4可能在調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡、凋亡細(xì)胞的清除、調(diào)控Treg的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能等免疫環(huán)節(jié)中起重要作用，維護(hù)機(jī)體的自身穩(wěn)態(tài)和免疫耐受［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清Tim-4水平高于健康對(duì)照組，且Tim-4是NSCLC患者生存的危險(xiǎn)因素，是NSCLC患者潛在的生物標(biāo)志物［6］。本研究通過(guò)分析化療前后血清Tim-4水平的變化，探討血清Tim-4水平與NSCLC之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步研究其在NSCLC患者的疾病進(jìn)展、化療反應(yīng)等有關(guān)方面的臨床價(jià)值，為NSCLC患者化療干預(yù)提供參考信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2013年1月1日至2017年1月1日，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫第二醫(yī)院呼吸科收治的49例NSCLC患者的臨床資料，其中男37例，女12例，年齡40～85歲，平均（64.0±11.5）歲；病理分型：腺癌25例，鱗癌24例，均為肺源性且EGFR、ALK基因檢測(cè)陰性，排除其他系統(tǒng)的惡性腫瘤及癌前病變史。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法 所有患者均在確診后首次、第3次、第5次化療前無(wú)菌狀態(tài)下采集靜脈血約5 ml，在2 h內(nèi)離心、沉淀、分離出血清，置于-80℃冰箱保存，采用ELISA法檢測(cè)Tim-4水平。

1.3 化療方案及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 所有患者均未接受放療和靶向治療，采用含鉑劑的一線化療，鉑劑為順鉑（75 mg/m2，第1天），其他聯(lián)合的藥物為吉西他濱（1 000 mg/m2，第1、8天）、或培美曲塞（500 mg/m2,第1天）、或多西他賽（75 mg/m2，第1天），以21 d為一個(gè)周期。療效評(píng)定按照實(shí)體瘤的療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）執(zhí)行［7］，完全緩解（CR）：所有可測(cè)量病灶消失；部分緩解（PR）：雙徑可測(cè)量病灶最大兩垂直徑乘積總和減少≥50%，或單徑可測(cè)量病灶各最大徑總和減少≥50%；穩(wěn)定（SD）：減少＜50%或增大＜25%，無(wú)新病灶；進(jìn)展（PD）：增大≥25%，或出現(xiàn)新病灶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，通過(guò)受試者工作特征曲線（ROC曲線）來(lái)評(píng)估化療后血清Tim-4水平變化預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展或治療反應(yīng)等的可靠性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對(duì)49例患者進(jìn)行含鉑劑的一線化療，按RECIST實(shí)體瘤療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，第3次化療前和第5次化療前療效評(píng)估后，實(shí)際CR患者為0，故本文中的緩解期均為部分緩解期。因家庭因素、經(jīng)濟(jì)因素、患者自身身體狀況、選擇其他治療方案等限制，完成第3次化療前評(píng)估的有47例，而完成第5次化療前評(píng)估的僅有39例。

2.2 第3次、第5次化療前不同分期患者血清Tim-4水平評(píng)估 根據(jù)RECIST實(shí)體瘤的療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，第3次化療前評(píng)估：緩解15例，穩(wěn)定21例，進(jìn)展11例；第5次化療前評(píng)估：緩解15例，穩(wěn)定15例，進(jìn)展9例。第3次、第5次化療前各期患者血清Tim-4水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第3次化療前進(jìn)展期患者血清Tim-4水平明顯高于緩解期和穩(wěn)定期患者，而第5次化療前緩解期患者血清Tim-4水平低于穩(wěn)定期、進(jìn)展期患者，見(jiàn)表1。進(jìn)一步行SNK檢驗(yàn)顯示，第3次化療前進(jìn)展期患者血清Tim-4水平與緩解期、穩(wěn)定期患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第5次化療前緩解期患者血清Tim-4水平與進(jìn)展期患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 第3次、第5次化療前不同分期患者血清Tim-4（pg/ml）水平比較 (±s)

表1 第3次、第5次化療前不同分期患者血清Tim-4（pg/ml）水平比較 (±s)

注：與穩(wěn)定期、進(jìn)展期比較，1）P=0.001；2）P=0.007

組別 n 第3次化療前 n 第5次化療前緩解期 15 166.41±110.311） 15 114.72±75.152）穩(wěn)定期 21 269.90±186.93 15 243.78±214.64進(jìn)展期 11 459.48±223.89 9 384.93±273.88

2.3 血清Tim-4水平與NSCLC患者的疾病進(jìn)展 本研究同時(shí)比較了進(jìn)展期與緩解期+穩(wěn)定期患者血清Tim-4水平，t檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展期患者血清Tim-4水平明顯高于緩解期+穩(wěn)定期患者（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 第3次、第5次化療前進(jìn)展期與緩解期+穩(wěn)定期患者血清Tim-4（pg/ml）水平比較(±s)

注：與緩解+穩(wěn)定組比較，1）P=0.001；2）P=0.010

組別 n 第3次化療前 n 第5次化療前進(jìn)展期 11 459.48±223.891） 9 384.93±273.882）緩解+穩(wěn)定期 36 226.78±165.87 30 179.25±171.10

應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)血清Tim-4水平預(yù)測(cè)患者化療后疾病仍進(jìn)展的可靠性，第3次化療前，血清Tim-4水平預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的ROC曲線下面積（AUC）為 0.855，敏感度為 90.9%，特異度為69.4%，95%CI為0.746～0.963（P＜0.01），有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且有一定的準(zhǔn)確性。第5次化療前，血清Tim-4水平預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的AUC為0.856，敏感度77.8%，特異度83.3%，95%CI為0.728～0.983（P=0.001），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有一定的準(zhǔn)確性。見(jiàn)圖1。

圖1 血清Tim-4水平預(yù)測(cè)NSCLC患者疾病進(jìn)展的ROC曲線

2.4 血清Tim-4與NSCLC患者化療反應(yīng) 根據(jù)RECIST實(shí)體瘤的療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，相對(duì)來(lái)說(shuō)緩解期患者化療反應(yīng)較好，而穩(wěn)定期和進(jìn)展期患者則化療反應(yīng)欠佳，故將緩解期與穩(wěn)定期+進(jìn)展期患者的血清Tim-4水平進(jìn)行比較。t檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)第3次和第5次化療前評(píng)估，緩解期患者血清Tim-4水平均低于穩(wěn)定期+進(jìn)展期，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

應(yīng)用ROC曲線來(lái)評(píng)價(jià)血清Tim-4水平預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的可靠性。第3次、第5次化療前評(píng)估發(fā)現(xiàn)化療反應(yīng)較好者的AUC分別為0.188、0.146，兩者均小于0.5，故無(wú)價(jià)值。然而，根據(jù)ROC曲線，第3次化療前，血清Tim-4水平預(yù)測(cè)化療反應(yīng)欠佳者的AUC為0.813，敏感度96.9%，95%CI為0.666～0.959；第5次化療前，血清Tim-4預(yù)測(cè)化療反應(yīng)欠佳者的AUC為0.854,敏感度95.8%，95%CI為0.730～0.978；且P均＜0.05，說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但二者的特異度均不高，分別為60.0%、66.7%，見(jiàn)圖2。

表3 第3次、第5次化療前緩解期與穩(wěn)定期+進(jìn)展期患者血清Tim-4（pg/ml）水平比較(±s)

表3 第3次、第5次化療前緩解期與穩(wěn)定期+進(jìn)展期患者血清Tim-4（pg/ml）水平比較(±s)

注：與穩(wěn)定+進(jìn)展期比較，1）P=0.001；2）P=0.008

組別 n 第3次化療前 n 第5次化療前緩解期 15 166.41±110.311） 15 114.72±75.152）穩(wěn)定+進(jìn)展期 32 335.07±216.98 24 296.71±242.91

圖2 血清Tim-4水平預(yù)測(cè)NSCLC患者化療反應(yīng)欠佳者的ROC曲線

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2015年，中國(guó)約有429.2萬(wàn)的腫瘤新增病例，281.4萬(wàn)腫瘤相關(guān)的死亡病例。相比于其他系統(tǒng)的惡性腫瘤，肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是癌癥死因之首［8］。有報(bào)道，NSCLC約占肺癌統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的85%，約75%的病例確診時(shí)即處于中晚期，5年生存率僅17.8%［9］。面對(duì)如此龐大的數(shù)據(jù)，肺癌的早期發(fā)現(xiàn)與診斷非常重要，同時(shí)對(duì)于已經(jīng)確診的患者，選擇合理的治療方案、有效評(píng)估治療效果、及時(shí)調(diào)整治療方案則是我們臨床醫(yī)師工作的主題。

人Tim-4是一種包含378個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，由一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)信號(hào)序列構(gòu)成［3-4］。Tim-4在抗原提呈細(xì)胞上表達(dá)，其作為磷脂酰絲氨酸（PS）的受體，通過(guò)與PS的相互作用，控制活化的T細(xì)胞功能，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的活性，Tim-4可能成為抗腫瘤治療潛在的靶點(diǎn)［10］。Tim-4在自身免疫性疾病、哮喘、腦卒中等疾病中的作用越來(lái)越清晰，而其在腫瘤中的作用尚處于探索中。在陳治中［3］等人的NO.81260007的研究中，曾采用3個(gè)腫瘤細(xì)胞系作為體外細(xì)胞凋亡模型，研究結(jié)果暗示人Tim-4基因與腫瘤凋亡細(xì)胞的清除有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織Tim-4的表達(dá)明顯高于癌旁組織［11］。

來(lái)自腫瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄?shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，Tim-3和Tim-4上調(diào)了腫瘤相關(guān)的樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，此調(diào)控減弱了腫瘤疫苗和化療的抗腫瘤作用［10］。Dorfman 等［5］亦發(fā)現(xiàn) Tim-4可在多種腫瘤組織上高表達(dá)，并指出Tim-4有望成為腫瘤的標(biāo)記物。而有關(guān)Tim-4與肺癌，有研究發(fā)現(xiàn)Tim-4表達(dá)強(qiáng)度與NSCLC腫瘤組織的分化程度有關(guān)，分化程度低的表達(dá)高，此外，NSCLC的癌組織中Tim-4的表達(dá)高于癌旁組織［12］。此外研究還提出，Tim-4表達(dá)增強(qiáng)是NSCLC患者預(yù)后不良的因素，其表達(dá)增強(qiáng)不利于Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者的遠(yuǎn)期生存［12］。

本研究，在NSCLC患者化療期間檢測(cè)了血清Tim-4水平，并根據(jù)RECIST實(shí)體瘤的療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)將檢測(cè)患者分期。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，不僅第3次與第5次化療前各期血清Tim-4水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第3次化療前進(jìn)展期Tim-4水平明顯高于緩解期和穩(wěn)定期，而第5次化療前緩解期血清Tim-4水平顯著低于穩(wěn)定期、進(jìn)展期。值得思考的是，血清Tim-4水平變化是否與NSCLC患者的疾病進(jìn)展有關(guān)？其水平變化能否預(yù)測(cè)化療反應(yīng)？本研究進(jìn)一步比較了進(jìn)展期與緩解期+穩(wěn)定期患者血清Tim-4水平，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是第3次還是第5次化療前評(píng)估，進(jìn)展期患者血清Tim-4水平均明顯高于穩(wěn)定期+緩解期患者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，按95%的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，有理由認(rèn)為進(jìn)展期NSCLC患者血清Tim-4水平與穩(wěn)定期+緩解期不同。然而，這種差異能否反映疾病進(jìn)展？且可靠性如何？本研究應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)血清Tim-4水平預(yù)測(cè)NSCLC患者化療后疾病仍進(jìn)展的可靠性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)第3次、第5次化療前，血清Tim-4水平預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的AUC分別為 0.855、0.856，95%CI為 0.746～0.963、0.728～0.983，P均＜0.05；說(shuō)明化療后血清Tim-4水平升高預(yù)測(cè)NSCLC疾病進(jìn)展有一定的準(zhǔn)確性。該結(jié)果與我們的預(yù)期一致，當(dāng)NSCLC患者行化療評(píng)估時(shí)，若腫瘤的生物標(biāo)志物大幅度上升或者下降不明顯，需要考慮是否存在疾病進(jìn)展。尋找上述結(jié)果的理論依據(jù)，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Tim-4高表達(dá)能夠加速細(xì)胞周期，進(jìn)而加快肺癌細(xì)胞的增殖［13］，此外，Tim-4高表達(dá)增強(qiáng)了癌細(xì)胞侵襲和遷移的能力，與肺癌惡化密切相關(guān)［14］。

對(duì)于已確診的NSCLC患者，為提高患者的總生存期（OS），在治療階段發(fā)現(xiàn)患者是正對(duì)治療產(chǎn)生積極的療效還是繼續(xù)向疾病更晚階段進(jìn)展，這點(diǎn)至關(guān)重要。是否存在某種標(biāo)記物用以區(qū)分這2組患者，則正是我們希望探索的。在評(píng)估治療反應(yīng)時(shí)，本研究將患者分為反應(yīng)良好組（緩解期的患者）和反應(yīng)欠佳組或無(wú)反應(yīng)組（穩(wěn)定期或進(jìn)展期的患者）。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)第3次和第5次化療前評(píng)估，緩解期患者血清Tim-4水平均低于穩(wěn)定期+進(jìn)展期，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨后依據(jù)ROC曲線評(píng)價(jià)血清Tim-4水平預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的可靠性。盡管血清Tim-4水平發(fā)現(xiàn)化療反應(yīng)較好者的AUC分別為0.188、0.146，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，根據(jù)ROC曲線，第3次、第5次化療前，血清Tim-4預(yù)測(cè)化療反應(yīng)欠佳者的AUC分別為 0.813和 0.854，95%CI為 0.666～0.959、0.730～0.978，P均＜0.05。說(shuō)明血清Tim-4水平預(yù)測(cè)NSCLC患者中化療反應(yīng)欠佳者有一定的可靠性。這可對(duì)臨床醫(yī)師在完成NSCLC患者化療前的評(píng)估后，考慮是否更換治療方案提供重要信息。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者化療過(guò)程中監(jiān)測(cè)血清Tim-4水平，有助于識(shí)別疾病進(jìn)展或治療反應(yīng)欠佳的患者，有助于制定更合理的治療方案，對(duì)NSCLC患者的個(gè)體化管理提供重要的參考信息。

不足之處在于納入的患者數(shù)偏少，研究結(jié)果更待于大樣本的臨床研究。后期，我們會(huì)繼續(xù)探尋Tim-4與NSCLC之間的關(guān)聯(lián)。期待Tim-4作為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)，期待腫瘤免疫治療的持續(xù)發(fā)展。