周禮華，劉函冰，陳韓磊

（蚌埠醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽 蚌埠 233000）

擬除蟲菊酯（pyrethroid）是人工合成的新型 農(nóng)藥，因其具有高效性、低毒性及低環(huán)境持久性等特點廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲防治、家庭及公共場所中的衛(wèi)生害蟲防治等方面。目前，擬除蟲菊酯類殺蟲劑的應(yīng)用已超過全世界殺蟲劑的30%［1］。隨著使用量增加，毒性作用逐漸被重視。研究顯示，擬除蟲菊酯可造成哺乳類動物免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)損害［2-4］，其中神經(jīng)系統(tǒng)的毒性備受關(guān)注。腦發(fā)育過程中接觸農(nóng)藥可能是神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的重要危險因素，未成年期暴露會使動物成年后再暴露時易感性增加，而擬除蟲菊酯暴露是帕金森病變的危險因素［5-7］。神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)元間、神經(jīng)元與靶細(xì)胞間發(fā)揮信號傳遞功能的化學(xué)物質(zhì)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括5-羥色胺（serotonin，5-HT）、多巴胺（dopamine，DA）、去甲腎上腺素（noradrenaline，NE）等，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的異常影響著神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，進而干擾機體運動、睡眠、情感等活動［8］。本研究選用Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑——氯氰菊酯（cypermethrin，CYP）作為代表，研究CYP對C57BL/6未成年小年鼠大腦皮質(zhì)及血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，探討CYP對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性機制，為規(guī)范擬除蟲菊酯類殺蟲劑合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6未成年小鼠18只，4周齡，性別不限，體重（12.39±1.28）g，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供（許可證號：SCXK（蘇）2017-0001），飼養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，濕度40%～70%。

1.2 藥品與試劑 CYP標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物有限公司）；血清及大腦皮質(zhì)5-HT、DA、NE酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組與染毒方法 將未成年小鼠隨機為：對照組、CYP 50 mg/kg及CYP 100 mg/kg暴露組，每組6只。實驗前各組小鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。暴露組分別給予CYP 50 mg/kg及100 mg/kg腹腔注射（CYP用玉米油溶解），每日1次，連續(xù)4 d。對照組給予等體積生理鹽水代替。每日注射前稱取小鼠體重，同時，觀察實驗小鼠日?；顒?、情緒、攝食、飲水的變化。

1.3.2 小鼠血清制備及5-HT、DA、NE含量測定 小鼠經(jīng)水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射麻醉后，摘除眼球取血，每只小鼠收集血液0.4 ml，EP管內(nèi)室溫靜置2 h，然后2 000×g離心15 min，血清分離后置于-80℃冰箱儲存。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟測定血清中5-HT、DA、NE的含量。

1.3.3 小鼠腦組織臟器系數(shù)分析 小鼠摘眼球取血后，立即將其斷頭處死，用剪刀依次剪開皮膚及顱骨，小心取出腦組織，準(zhǔn)確稱量腦組織重量（以上操作在冰上進行），計算公式：小鼠臟器系數(shù)=腦組織重量（g）/小鼠體重（g）×100。

1.3.4 小鼠大腦皮質(zhì)制備及5-HT、DA、NE含量測定 腦組織稱重后，仔細(xì)分離小鼠大腦皮質(zhì)，然后用0.9%生理鹽水沖洗，濾紙吸干、稱重、剪碎，加入預(yù)冷生理鹽水（1∶9）制成10%的組織勻漿。將勻漿液5 000×g離心10 min后取上清。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟測定大腦皮質(zhì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE含量。樣品蛋白濃度測定采用BCA法。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析及LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況觀察及腦的臟器系數(shù)測定 實驗期間，對照組小鼠活動如常；暴露組小鼠精神萎靡，體毛蓬亂，眼角周圍有不同程度分泌物殘留。CYP暴露組小鼠腦臟器系數(shù)高于對照組，其中CYP 100 mg/kg暴露組臟器系數(shù)與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 CYP暴露對未成年小鼠臟器系數(shù)的影響

2.2 CYP對小鼠大腦皮質(zhì)5-HT、DA及NE的影響 CYP 50 mg/kg及100 mg/kg暴露組小鼠大腦皮質(zhì)5-HT、DA含量均低于對照組（P＜0.05），CYP 100 mg/kg暴露組DA含量低于CYP 50 mg/kg暴露組（P＜0.05）；CYP暴露組與對照組NE含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 未成年小鼠大腦皮質(zhì)5-HT、DA、NE含量比較

2.3 CYP對小鼠血清5-HT、DA及NE的影響 CYP 50 mg/kg及100 mg/kg暴露組小鼠血清5-HT、DA含量均低于對照組（P＜0.05），CYP 100 mg/kg暴露組5-HT、DA含量低于CYP 50 mg/kg暴露組（P＜0.05）；CYP暴露組與對照組NE含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 未成年小鼠血清5-HT、DA、NE含量比較

3 討論

擬除蟲菊酯是脂溶性化合物，能夠穿過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，動物未成年期大腦處于高度活躍的神經(jīng)發(fā)育階段，未成年期暴露易導(dǎo)致潛在的神經(jīng)毒性，且使動物成年后再暴露時易感性增加［8-9］。擬除蟲菊酯從血液和神經(jīng)組織中消除緩慢，反復(fù)暴露會導(dǎo)致毒物在體內(nèi)蓄積，增加神經(jīng)退行性疾病的易感性［10］。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括5-HT、DA、NE等，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的異常影響著神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。Karen等［11］研究發(fā)現(xiàn)，擬除蟲菊酯能降低C57BL/6成年小鼠紋狀體突觸小體對DA的攝取，影響小鼠的運動及攝食。DA廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，大腦中DA含量與肌肉協(xié)調(diào)能力密切相關(guān)，當(dāng)腦組織DA含量降低時，動物運動能力下降［12］。DA合成速度主要取決于體內(nèi)的酪氨酸羥化酶，擬除蟲菊酯可通過抑制體內(nèi)酪氨酸羥化酶的活力，催化合成DA含量減少［13］。NE在DA作用的基礎(chǔ)上引發(fā)機體進行一系列動作，NE參與維持中樞神經(jīng)遞質(zhì)之間的動態(tài)平衡。5-HT又名血清素，是一種神經(jīng)遞質(zhì)和內(nèi)源性活性物質(zhì)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織。擬除蟲菊酯類代謝產(chǎn)物殘留會造成腦組織各部位5-HT含量下降，且降低程度與擬除蟲菊酯的使用量及使用頻率有關(guān)［14］。擬除蟲菊酯引起Na+通道關(guān)閉延遲，神經(jīng)元去極化，神經(jīng)元過度興奮，進而干擾神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的正常傳遞［15］。

本研究以CYP 50 mg/kg、100 mg/kg對C57BL/6未成年小鼠進行腹腔注射，觀察小鼠腦臟器系數(shù)、大腦皮質(zhì)及血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，暴露組（CYP 100 mg/kg）小鼠腦的臟器系數(shù)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。暴露組小鼠大腦皮質(zhì)及血清中5-HT、DA含量低于對照組，且CYP 100 mg/kg暴露組小鼠大腦皮質(zhì)及血清中DA含量和血清中5-HT含量低于CYP 50 mg/kg組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。由于神經(jīng)遞質(zhì)測定方法靈敏度較高，特別是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的個體差異較大，本次實驗NE在腦皮質(zhì)和血清中沒有達(dá)到較為一致的變化趨勢，這與柴曉靜等［16］的研究不完全一致，可能與暴露方式、暴露時間、暴露劑量以及實驗動物的樣本量有關(guān)。

綜上所述，CYP暴露影響C57BL/6未成年小鼠腦臟器系數(shù)，降低小鼠大腦皮質(zhì)及血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA的含量，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化可能是CYP導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，神經(jīng)損傷的具體途徑及相關(guān)機制是本實驗下一步的研究方向。