韓靜 李亞偉 劉艷萍 劉宏

(1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院體檢中心,河北 石家莊 050000；2石家莊市第三醫(yī)院心內(nèi)科)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)大部分患者無(wú)明顯癥狀，僅有少部分出現(xiàn)消化不良、乏力、肝脾腫大、肝區(qū)隱痛等非特異性癥狀〔1,2〕。NAFLD病情進(jìn)展緩慢，但可直接導(dǎo)致失代償期肝硬化、肝細(xì)胞癌，并且可誘導(dǎo)2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，影響患者的健康和生活質(zhì)量〔3〕。目前NAFLD的具體發(fā)病機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一定論，“二次打擊”學(xué)說(shuō)是認(rèn)可度較高的一種理論，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為胰島素抵抗(IR)導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積為第一次打擊，在此基礎(chǔ)上發(fā)生的脂質(zhì)過(guò)氧化等反應(yīng)、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可對(duì)肝細(xì)胞造成損傷，形成第二次打擊〔4～6〕。由此可見，脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是“二次打擊”學(xué)說(shuō)中的重要步驟〔7〕。降脂理肝湯為張?jiān)迄i教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，臨床研究證明，降脂理肝湯治療NAFLD療效顯著，但其具體的作用機(jī)制尚未明確〔8〕。本研究通過(guò)觀察不同劑量的降脂理肝湯對(duì)NAFLD模型大鼠脂代謝指標(biāo)、炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，探討降脂理肝湯治療NAFLD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠50只，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(湘)2009-0012。均為雄性，體重130～150 g，平均(142.24±4.36)g，飼養(yǎng)溫度22～24℃，相對(duì)濕度55%～65%，每天光照12 h，環(huán)境噪音≤85 dB。

1.1.2主要藥物和試劑 降脂理肝湯以澤瀉、丹參為主藥，成分為澤瀉10 g、丹參10 g、決明子30 g、海藻30 g、郁金10 g、荷葉10 g，藥材均來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥房，配好藥方后進(jìn)行煎煮，制成生藥濃度分別為0.46、0.92、1.84 g/ml的濃縮液。腫瘤壞死因子(TNF)-α、脂聯(lián)素(APN)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.1.3主要儀器 石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司，RM2235)，全自動(dòng)生化分析儀(日立，7600)，倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯，ckx41)，全自動(dòng)酶標(biāo)生化儀(美國(guó)伯樂(lè)公司，680)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。

1.2.2造?！?〕及給藥方法 正常對(duì)照組采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配比：84%基礎(chǔ)飼料+14%豬油+2%膽固醇。均喂養(yǎng)8 w，期間所有大鼠自由活動(dòng)，自由飲水。8 w后從高脂飼養(yǎng)的大鼠中每組隨機(jī)抽取1只，脫頸椎處死，取肝組織進(jìn)行HE染色，根據(jù)病理圖片判定NAFLD模型大鼠是否造模成功。確定造模成功后，各組剩余的大鼠仍保持之前喂養(yǎng)的方式，并灌胃給藥。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠給予生理鹽水5.5 mg/kg灌胃；低、中、高劑量組大鼠分別給予降脂理肝湯2.3、4.6、9.2 g生藥/kg體重灌胃。所有大鼠連續(xù)灌胃8 w。

1.2.3HE染色 脫頸椎處死大鼠后，取其肝臟，4℃冰浴滅菌生理鹽水沖洗，置于10%的甲醛緩沖液中固定24 h，常規(guī)脫水包埋后采用石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，厚度約為5 μm。取切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中脫蠟處理，置于100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、80%、70%的酒精中進(jìn)行水化處理，自來(lái)水沖洗2 min，蘇木素染色3 min，自來(lái)水沖洗2 min，1%鹽酸酒精分化30 s，自來(lái)水沖洗2 min，氨水反藍(lán)，自來(lái)水沖洗1 min，0.5%伊紅液染色3 min，自來(lái)水沖洗1 min，置于70%、80%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ的酒精中進(jìn)行脫水處理，二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.2.4大鼠的一般情況 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察所有大鼠的精神狀況、活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤度、飲食情況、排泄情況和死亡情況等。

1.2.5血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定 連續(xù)灌胃給藥8 w后下腔靜脈采血5 ml，3 000 r/min離心10 min，取上層血清。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、游離脂肪酸(FFA)的水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)TNF-α、APN水平，具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書。

1.2.6肝勻漿指標(biāo)測(cè)定 連續(xù)灌胃給藥8 w后，取肝組織1 g，加入生理鹽水10 ml，制備成10%的肝勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)肝勻漿中的SOD、MDA水平，具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，多組間計(jì)量資料比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HE染色情況 正常對(duì)照組肝小葉保持完整的結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞索整齊排列，肝細(xì)胞呈多邊形，核大而圓，無(wú)纖維組織增生。造模大鼠肝細(xì)胞排列無(wú)規(guī)律，伴氣球樣變，存在較明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)肝纖維化及肝硬化。見圖1。

2.2各組大鼠一般情況 正常對(duì)照組大鼠精神狀況良好、活動(dòng)頻繁、毛發(fā)有光澤、飲食正常、排泄正常、無(wú)死亡；模型對(duì)照組大鼠精神萎靡、較少活動(dòng)、毛發(fā)油亮且部分大鼠背部毛發(fā)脫落、飲食正常、排泄正常、無(wú)死亡。低、中、高劑量組大鼠精神一般、時(shí)?；顒?dòng)、毛發(fā)油亮、飲食正常、排泄正常、無(wú)死亡。

2.3各組脂代謝情況 各組TC水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；各組TG、LDL、FFA水平比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。模型對(duì)照組的TG、LDL、FFA明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；高劑量組的TG、LDL、FFA明顯低于模型對(duì)照組和低劑量組(P<0.05)；中劑量組的TG明顯低于模型對(duì)照組和低劑量組，LDL明顯低于模型對(duì)照組，F(xiàn)FA明顯低于模型對(duì)照組、高于正常對(duì)照組(P<0.05)；低劑量組的TG、LDL、FFA明顯低于模型對(duì)照組、高于正常對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

圖1 典型樣本病理改變(×400)

2.4各組TNF-α、APN水平比較 各組TNF-α、APN水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。模型對(duì)照組的TNF-α明顯高于正常對(duì)照組，APN明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)；高劑量組的TNF-α明顯低于模型對(duì)照組，APN明顯高于中、低劑量組、模型對(duì)照組(P<0.05)；中劑量組的TNF-α明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05)，APN明顯高于低劑量組、模型對(duì)照組，低于正常對(duì)照組(P<0.05)；低劑量組的TNF-α明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05)，APN明顯高于模型對(duì)照組、低于正常對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.5各組SOD、MDA水平比較 各組SOD、MDA水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。模型對(duì)照組的SOD明顯低于正常對(duì)照組，MDA明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；高、中劑量組的SOD明顯高于低劑量組、模型對(duì)照組，低于正常對(duì)照組(P<0.05)，MDA明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05)；低劑量組的SOD明顯高于模型對(duì)照組、低于正常對(duì)照組(P<0.05)，MDA明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組脂代謝情況、TNF-α、APN、SOD、MDA水平比較

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型對(duì)照組比較：2)P<0.05；與中劑量組比較：3)P<0.05；與低劑量組比較：4)P<0.05

3 討 論

隨著代謝綜合征和肥胖癥在全球的流行，NAFLD的患病率明顯上升，成為全世界重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題〔10〕。西藥治療NAFLD療效單一，且存在不同毒性和不良反應(yīng)，近年來(lái)中醫(yī)治療NAFLD的相關(guān)研究顯著增多，散瘀化濁湯、降脂理肝湯等中藥湯劑在臨床上也取得了較好的療效〔11〕。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為NAFLD屬于“積證”、“痰證”、“脅痛”、“肥氣病”等范疇。NAFLD是肝虛、脾虛、腎虛為本，而痰濁瘀血為標(biāo)的病證，在疾病前期多由于過(guò)食肥甘厚味、情志失調(diào)、勞逸失度或久病體虛導(dǎo)致肝失疏泄、肝郁氣滯、腎陽(yáng)虧虛、脾失健運(yùn)，進(jìn)而導(dǎo)致瘀血阻滯、脂濁積聚，痹阻于肝臟脈絡(luò)，氣血痰瘀互結(jié)于脅下，日久肝臟受損〔12,13〕。NAFLD在中醫(yī)學(xué)上可分為肝郁脾虛證、痰濕內(nèi)阻證、氣滯血瘀證、濕熱內(nèi)蘊(yùn)證、肝陰不足證，其治療思路為補(bǔ)益肝腎、疏肝健脾、化瘀通絡(luò)、祛痰泄?jié)?、益氣養(yǎng)陰〔14〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明NAFLD模型大鼠存在明顯的脂代謝紊亂，而降脂理肝湯可改善NAFLD模型大鼠的脂代謝水平，且中劑量和高劑量的療效更顯著。

降脂理肝湯主要由澤瀉、丹參、決明子、海藻、郁金、荷葉等六味中藥組成，方中澤瀉、丹參為主藥，其中澤瀉利濕降濁、健脾寧心，丹參活血化瘀、清心除煩；決明子、海藻為輔藥，決明子清肝明目、潤(rùn)腸通便，海藻利水清熱、消痰軟堅(jiān)；郁金為佐藥，具有通絡(luò)止痛、行氣化瘀的功效，并可與丹參藥性結(jié)合，起到疏理肝絡(luò)、活血化瘀、消除脅痛的作用；荷葉為使藥，具有升清降濁、散瘀祛濕的作用。諸藥聯(lián)合共奏補(bǔ)益肝腎、疏肝健脾、氣行郁解、痰化濁降、血活瘀消之功效〔15,16〕。

APN是一種胰島素增敏激素，可激活腺苷酸活化蛋白激酶、抑制Toll樣受體4介導(dǎo)的通路，進(jìn)而增強(qiáng)胰島素敏感性，改善IR。TNF-α為“二次打擊”學(xué)說(shuō)中的重要炎性因子，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分泌，可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎性因子，級(jí)聯(lián)放大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)氧化應(yīng)激，在NAFLD的發(fā)展中起到重要作用。SOD是氧自由基的自然天敵，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能將體內(nèi)的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫再進(jìn)一步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為水。MDA是氧化終產(chǎn)物，其水平能反映氧化應(yīng)激程度，且MDA能引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子交聯(lián)聚合，具有一定的細(xì)胞毒性〔17,18〕。本研究結(jié)果顯示，NAFLD模型大鼠APN水平明顯下降，且存在明顯的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，而降脂理肝湯可改善NAFLD模型大鼠APN水平，降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，這可能是降脂理肝湯治療NAFLD的機(jī)制之一。