夏九成 龍廷 秦達(dá)念

(1攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川 攀枝花 617000；2汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室)

神經(jīng)系統(tǒng)與內(nèi)分泌系統(tǒng)之間存在緊密聯(lián)系，而下丘腦在整個(gè)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中處于核心地位〔1〕。隨著年齡的增長，生物各部分功能出現(xiàn)衰退，下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌功能發(fā)生紊亂，可誘發(fā)機(jī)體能量代謝失衡、肥胖、自主神經(jīng)功能混亂、高血糖、高血壓、胰島素抵抗和性功能勃起障礙等多種代謝綜合征；同時(shí)糖尿病(高血糖)、高血壓和高脂血癥等常見的老年疾病所產(chǎn)生的炎癥因子又會反過來作用于下丘腦細(xì)胞，加重中樞神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的失調(diào)，推動衰老的不可逆發(fā)展〔2,3〕。利用大鼠、小鼠等下丘腦原代細(xì)胞作為的神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)研究的細(xì)胞體外模型是目前研究熱點(diǎn)之一〔4〕。但由于原代細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)雜、耗時(shí)且細(xì)胞均質(zhì)性差。所以用恰當(dāng)?shù)募?xì)胞株系代替原代細(xì)胞作為神經(jīng)元的研究模型是一個(gè)不錯(cuò)的選擇〔5～8〕。NG108-15細(xì)胞是一個(gè)由小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤與大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞雜交后獲得細(xì)胞系。在其分化后，細(xì)胞可以形成類似于神經(jīng)突觸的突起。因此，許多研究均采用NG108-15細(xì)胞系作為研究神經(jīng)元功能的重要細(xì)胞模型〔9,10〕。然而由于其雜合性，因此很難確定其細(xì)胞的神經(jīng)內(nèi)分泌特性是偏向于小鼠還是大鼠，從而給相關(guān)的細(xì)胞分子生物學(xué)研究帶來困難。為了使細(xì)胞試驗(yàn)與動物試驗(yàn)結(jié)果吻合，提高研究結(jié)果的價(jià)值。本研究設(shè)計(jì)了兩組分別來自大鼠和小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌基因的引物序列來分析基因表達(dá)的特性，以確定該細(xì)胞系的適合性。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)試劑與材料 NG108-15細(xì)胞系(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室)，新生大鼠(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動物中心，合格證號No.20170803)，新生小鼠(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動物中心，合格證號No.20170803)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(青霉素+鏈霉素，Gibco)，雙丁酰環(huán)磷酸腺苷(dc-AMP，Sigma)，胰酶，神經(jīng)元專用培養(yǎng)基(neurobasal medium)，B27，L-谷氨酸，阿糖胞苷(Sigma)，磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液，RNA提取試劑盒(Takara)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，SYBR熒光定量PCR試劑盒(Takara)，瓊脂糖，溴化乙錠。

1.2方法

1.2.1NG108-15細(xì)胞的分化培養(yǎng) 將NG108-15細(xì)胞按1×104個(gè)/ml密度接種到直徑為35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入1 ml DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后，加入含1 mmol/L雙丁酰環(huán)磷酸腺苷的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。此后每隔3 d換液1次，7 d后待細(xì)胞完全分化出細(xì)胞突觸后，收集所培養(yǎng)細(xì)胞待用。

1.2.2原代細(xì)胞的培養(yǎng) 分別將剛出生的小鼠和大鼠帶回實(shí)驗(yàn)室，用解剖工具在低溫?zé)o菌條件下快速取出下丘腦組織，并用胰酶在37℃下將下丘腦組織消化為單細(xì)胞懸液。將此細(xì)胞懸液按1×104個(gè)/ml密度接種到直徑為35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入1 ml含B27的neurobasal medium培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)第2天加入含阿糖胞苷的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)48 h后，換回含B27的neurobasal medium培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，此后每3天換液1次，直到第7天原代細(xì)胞培養(yǎng)成熟，收集所培養(yǎng)的原代細(xì)胞待用。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄PCR 將上述收集的各組細(xì)胞，先用PBS進(jìn)行清洗，然后各加入0.5 ml RNA提取試劑進(jìn)行總RNA的提取，并用50 μl雙蒸水溶解所提取RNA后，放于-70℃冰箱保存待用。每組取7 μl總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作要求，將其逆轉(zhuǎn)錄為20 μl的cDNA，并放于20℃保存待用。每組取1 μl cDNA，按照SYBR熒光定量PCR試劑盒的操作要求，在ABI7500上進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測分析。擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)一步通過瓊脂糖電泳進(jìn)行成像分析。PCR反應(yīng)引物系列見表1，其中β-actin為內(nèi)參基因，其余的瘦素受體基因(lepr)、前阿黑皮素原基因(pomc)、神經(jīng)肽Y基因(npy)和刺鼠相關(guān)蛋白基因(agrp)均與下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

表1 熒光定量PCR的引物序列

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài) NG108-15細(xì)胞，大鼠及小鼠的下丘腦原代培養(yǎng)細(xì)胞在按各自的培養(yǎng)條件培養(yǎng)7 d后的結(jié)果見圖1。從圖1可以看出三類細(xì)胞均有神經(jīng)元的突觸分化，但NG108-15細(xì)胞體積較大，成分散生長。大鼠和小鼠的原代培養(yǎng)細(xì)胞，則體積較小，細(xì)胞成簇生長，細(xì)胞間有明顯的突觸聯(lián)系。

2.2兩組引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果 利用由大鼠基因設(shè)計(jì)的引物序列，檢測NG108-15細(xì)胞和大鼠原代細(xì)胞的基因擴(kuò)增效率，結(jié)果見表2和圖2A。內(nèi)參基因β-actin的擴(kuò)增在兩組細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增正常且無差異，說明兩組細(xì)胞的起始模板量相等。但剩余的所有基因卻只能在大鼠原代細(xì)胞中正常擴(kuò)增，而在NG108-15細(xì)胞卻擴(kuò)增失敗。利用小鼠基因設(shè)計(jì)的引物序列，檢測NG108-15細(xì)胞和小鼠原代細(xì)胞的基因擴(kuò)增效率，結(jié)果見表3和圖2B。所有基因能在NG108-15細(xì)胞和小鼠原代細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，且擴(kuò)增效率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

利用小鼠和大鼠的兩組引物序列，同時(shí)檢測NG108-15細(xì)胞的基因擴(kuò)增效率，結(jié)果見表4和圖3。所有來自小鼠的引物序列擴(kuò)增正常，而來自大鼠的引物序列則除了內(nèi)參基因β-actin 擴(kuò)增正常外，其他均擴(kuò)增失敗或擴(kuò)增效率低下。

從以上結(jié)果可以看出，盡管NG108-15細(xì)胞是由大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞與小鼠神經(jīng)母細(xì)胞通過細(xì)胞融合所得的雜交瘤細(xì)胞株系，但其有關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌有關(guān)的細(xì)胞分子生物學(xué)特性則更多的與小鼠原代細(xì)胞相近而與大鼠的差異較遠(yuǎn)。

圖1 各組細(xì)胞的形態(tài)(×100)

表2 大鼠基因設(shè)計(jì)的PCR引物序列在NG108-15細(xì)胞與大鼠下丘腦原代細(xì)胞中的熒光定量PCR結(jié)果次，n=3)

UD*為無法檢測；表4同

表3 小鼠基因設(shè)計(jì)的PCR引物序列在NG108-15細(xì)胞與小鼠下丘腦原代細(xì)胞中的熒光定量PCR結(jié)果次，n=3)

A：由大鼠基因設(shè)計(jì)的PCR引物(β-actin，lepr，pomc，npy，agrp)在大鼠下丘腦原代細(xì)胞和NG108-15細(xì)胞中的PCR擴(kuò)增結(jié)果，第1泳道為DNA分子標(biāo)記，其余奇數(shù)泳道為大鼠下丘腦原代細(xì)胞，偶數(shù)泳道為NG108-15細(xì)胞；B：由小鼠基因設(shè)計(jì)的PCR引物(β-actin，lepr，pomc，npy，agrp)在小鼠下丘腦原代細(xì)胞和NG108-15細(xì)胞中的PCR擴(kuò)增結(jié)果，第1泳道為DNA分子標(biāo)記，其余奇數(shù)泳道為小鼠下丘腦原代細(xì)胞，偶數(shù)泳道為NG108-15細(xì)胞圖2 由大、小鼠基因設(shè)計(jì)的PCR引物

表4 由小鼠基因和大鼠設(shè)計(jì)兩組PCR引物在NG108-15細(xì)胞中的熒光定量PCR結(jié)果次，n=3)

第1泳道為DNA分子標(biāo)記，其余奇數(shù)泳道為依據(jù)小鼠基因設(shè)計(jì)的引物序列，偶數(shù)泳道為依據(jù)大鼠基因設(shè)計(jì)的引物序圖3 大鼠與小鼠基因的引物序列

3 討 論

新分離的原代神經(jīng)細(xì)胞是研究神經(jīng)元生理及病理變化功能的最佳選擇。但存在的缺點(diǎn)主要是細(xì)胞分離培養(yǎng)復(fù)雜耗時(shí)，細(xì)胞死亡率較高，細(xì)胞存在異質(zhì)性。細(xì)胞系則具有培養(yǎng)方法簡單高效，均質(zhì)性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，細(xì)胞系是研究細(xì)胞功能的理想工具。NG108-15細(xì)胞系是一個(gè)重要的神經(jīng)細(xì)胞模型〔11，12〕。NG108-15細(xì)胞系可用于研究神經(jīng)細(xì)胞的離子通道、膜受體和神經(jīng)遞質(zhì)等生理生化特性。張柱霞等〔13〕研究了5-氮-2′脫氧胞苷對神經(jīng)細(xì)胞系NG108-15細(xì)胞周期的作用及相關(guān)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)5-aza-cdR可以抑制NG08-15細(xì)胞的增殖，其抑制作用可能是通過降低DNMT1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

雙丁酰環(huán)磷酸腺苷可以刺激NG108-15細(xì)胞分化，比如細(xì)胞直徑和神經(jīng)突起增長。許多研究均采用分化的NG108-15細(xì)胞作為研究神經(jīng)元離子通道和膜受體的重要工具〔14，15〕。但是很少有人考慮該雜合細(xì)胞的生化特性是偏向于大鼠還是小鼠細(xì)胞特性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在多個(gè)與神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)基因的表達(dá)研究方面，該細(xì)胞系更適合為小鼠的體外細(xì)胞研究模型。由此可以看出若要將NG108-15細(xì)胞系作為神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)研究的體外模型，其研究結(jié)果更適合與小鼠動物試驗(yàn)相結(jié)合。