任威 李娟

(湖北省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430079)

化療是治療肺癌的主要措施之一，然而化療藥品毒性強(qiáng)，甚至降低患者的免疫功能，因此，選擇一種療效顯著、安全性高的化療藥物尤為重要〔1，2〕。痰熱清注射液是一種中成藥，成分包括金銀花、黃芩及熊膽粉，對(duì)于各類感染性疾病有顯著治療效果〔3〕。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管抑素(AS)、內(nèi)皮抑素(ES)均為外周血管生成調(diào)節(jié)因子，主要通過抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖達(dá)到抗腫瘤目的〔4〕。本次研究進(jìn)一步分析痰熱清注射液輔助化療對(duì)Lewis肺癌模型小鼠免疫功能和VEGF、AS、ES水平的影響。

1 材料和方法

1.1材料 86只4～6周齡小鼠，購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重18～22 g，平均(20.31±0.72)g。Lewis肺癌瘤株購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司。DW-86L626型低溫冰箱購(gòu)于四川蜀科儀器有限公司，LD-5M立式低速冷凍離心機(jī)購(gòu)于青島海爾股份有限公司，精密移液器購(gòu)于端士Socorex 公司，BIO-RAD酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó) BIO-RAD伯樂公司。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Andy-gene公司提供)，包括小鼠外周血VEGF試劑盒(批號(hào)：HTAC017)、AS試劑盒(批號(hào)：HTAC011)、ES試劑盒(批號(hào)：HTAC023)、γ干擾素(IFN-γ)試劑盒(批號(hào)：HTAC015)、白細(xì)胞介素(IL)-2試劑盒(批號(hào)：HTAC012)、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(批號(hào)：HTAC009)。

1.2分組及接種方法 選取6只小鼠作為備用，其余80只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、順鉑組、痰熱清組及聯(lián)合組，每組20只。除對(duì)照組外，其他3組均行Lewis肺癌瘤株接種處理：應(yīng)用37℃的溫水對(duì)Lewis肺癌瘤株進(jìn)行復(fù)蘇處理，并調(diào)整瘤株密度至1×107/ml。選擇2只備用小鼠，定位其右腋，分別皮下接種0.1 ml瘤株，11 d后以脫頸法處死小鼠，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)較好的癌組織進(jìn)行洗凈處理，剪碎、研磨，提取細(xì)胞。再選2只備用小鼠進(jìn)行第二輪接種。重復(fù)上述操作至第三輪接種后，將最后提取的腫瘤細(xì)胞分別接種于順鉑組、痰熱清組與聯(lián)合組小鼠的右腋皮下。

1.3治療方法 接種后1 d，對(duì)照組注射1.5 mg/kg的生理鹽水，隔天1次；順鉑組注射1.5 mg/kg順鉑(德州德藥制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20023236)，隔天1次；痰熱清組經(jīng)腹腔注射痰熱清注射液(上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030054)，劑量為3.5 ml/kg，隔天1次；聯(lián)合組注射1.5 mg/kg順鉑+3.5 ml/kg痰熱清注射液，隔天1次。4組均持續(xù)注射2 w。

1.4指標(biāo)觀察 (1)順鉑組、痰熱清組及聯(lián)合組小鼠接種5、10、14 d時(shí)的腫瘤體積。應(yīng)用動(dòng)物腫瘤測(cè)量跟蹤系統(tǒng)，電子數(shù)顯卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)、最短徑，腫瘤體積=腫瘤最長(zhǎng)徑×最短徑×最短徑/2〔5〕。(2)4組小鼠接種14 d后的免疫指標(biāo)水平。以免疫透射比濁法檢測(cè)小鼠外周血中免疫球蛋白(Ig)G、補(bǔ)體C3水平，取外周血離心分離血清，通過標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在波長(zhǎng)340 nm處檢測(cè)血清IgG、補(bǔ)體C3水平，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。(3)4組的炎性因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)及血清VEGF、AS、ES水平。取4組小鼠適量股動(dòng)脈血后靜置30 min，4 000 r/min離心15 min，取上層血清并保存于DW-86L626型低溫冰箱中備用。應(yīng)用酶標(biāo)儀并以ELISA法及其配套試劑盒檢測(cè)VEGF、AS、ES、IL-2、TNF-α、IFN-γ等水平，嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書操作。

1.5統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS20.0軟件，兩兩比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1順鉑組、痰熱清組及聯(lián)合組小鼠接種后5、10、14 d時(shí)的腫瘤體積 接種后5 d，3組腫瘤體積無明顯差異(P>0.05)；接種后10、14 d，3組腫瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且聯(lián)合組腫瘤體積明顯小于順鉑組及痰熱清組(P<0.05)，見表1。

表1 順鉑組、痰熱清組及聯(lián)合組接種不同時(shí)間的腫瘤體積比較

與順鉑組比較：1)P<0.05；與痰熱清組比較：2)P<0.05；與本組接種后5 d比較：3)P<0.05；與本組接種后10 d比較：4)P<0.05

2.24組免疫指標(biāo)比較 4組IgG與C3水平整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。痰熱清組IgG與C3水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；順鉑組、聯(lián)合組IgG與C3水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，且聯(lián)合組的IgG與C3水平均明顯低于痰熱清組、高于順鉑組(P<0.05)。見表2。

表2 4組免疫指標(biāo)水平比較

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與順鉑組比較:2)P<0.05;與痰熱清組比較:3)P<0.05；下表同

2.34組炎性因子水平比較 4組IL-2、TNF-α及IFN-γ水平整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組、痰熱清組、聯(lián)合組的IL-2和IFN-γ水平均明顯低于對(duì)照組，TNF-α水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；痰熱清組IL-2、IFN-γ水平明顯高于順鉑組，TNF-α水平明顯低于順鉑組(P<0.05)。聯(lián)合組的IL-2水平明顯高于順鉑組，TNF-α水平明顯高于痰熱清組，IFN-γ水平明顯低于痰熱清組(P<0.05)，見表3。

表3 4組炎性因子水平比較

2.44組VEGF、ES及AS水平比較 4組間VEGF、ES及AS水平整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組、痰熱清組、聯(lián)合組的ES、AS水平明顯低于對(duì)照組，VEGF水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；聯(lián)合組、痰熱清組VEGF水平明顯低于順鉑組，ES水平明顯高于順鉑組(P<0.05)；痰熱清組AS水平明顯高于順鉑組(P<0.05)；聯(lián)合組ES、AS水平明顯低于痰熱清組，VEGF水平明顯高于痰熱清組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 4組VEGF、ES及AS水平比較

3 討 論

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病早期無顯著癥狀，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)。多數(shù)患者就診時(shí)已進(jìn)入中晚期，根治性治療難度較大，可經(jīng)化療延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間及提高生存質(zhì)量〔6，7〕。但是，在患者化療治療期間，機(jī)體免疫能力會(huì)受化療藥物的影響。為了提升化療效果并且降低化療藥物對(duì)正常細(xì)胞、免疫能力的影響，臨床中常在化療期間采用中藥制劑輔助治療，痰熱清注射液即為其中較常用的一種。痰熱清注射液屬于中藥復(fù)方制劑，生物調(diào)節(jié)性較好，目前已在惡性腫瘤治療中獲得廣泛使用〔8〕。

本研究結(jié)果顯示，痰熱清注射液輔助化療能更有效降低小鼠腫瘤體積，提示痰熱清注射液輔助化療能增強(qiáng)化療的效果。痰熱清注射液主要由黃芩、山羊角、熊膽粉、連翹、金銀花等五味清熱的中藥組成，其中黃芩為君藥，具有清熱解毒、止咳潤(rùn)肺的功效；山羊角和熊膽粉為臣藥，起到化痰止咳、解痙熄風(fēng)的作用；連翹、金銀花為佐藥，起到清熱解毒的作用〔9〕。痰熱清注射液可有效緩解肺癌小鼠咳嗽、咯痰等癥狀，聯(lián)合常規(guī)化療藥物順鉑可更好地改善小鼠的治療效果，進(jìn)而更有效地縮小腫瘤體積。本研究還顯示，使用順鉑進(jìn)行化療后，小鼠的免疫功能會(huì)受到一定的影響，而采用痰熱清注射液輔助化療可以減輕順鉑對(duì)小鼠免疫功能造成的影響。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，化療會(huì)導(dǎo)致小鼠的胸腺指數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、單根股骨骨髓細(xì)胞數(shù)降低，而痰熱清注射液輔助化療可明顯減輕這種現(xiàn)象，逆轉(zhuǎn)化療對(duì)小鼠免疫功能的影響〔10，11〕，這與本研究得到的結(jié)論相似，然而其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。肺癌小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、活化T細(xì)胞會(huì)分泌大量IFN-γ，在抗腫瘤免疫過程中發(fā)揮重要的作用；TNF-α由巨噬細(xì)胞與活化T細(xì)胞分泌，參與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過程；IL-2對(duì)細(xì)胞因子、干擾素成分可發(fā)揮誘導(dǎo)作用，對(duì)免疫調(diào)節(jié)有重要的作用，促進(jìn)Fas抗原表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果還顯示，順鉑可降低小鼠體內(nèi)IL-2和IFN-γ水平，增加TNF-α水平，而痰熱清注射液輔助化療可緩解IL-2和IFN-γ降低及TNF-α升高的程度，從而增強(qiáng)其淋巴細(xì)胞的抗腫瘤免疫活性，在有效緩解炎性反應(yīng)的同時(shí)改善其免疫狀態(tài)〔12〕。VEGF是一種促進(jìn)外周血管生成的因子，主要通過影響血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K起到調(diào)控的作用〔13〕；AS和ES是重要的血管生成抑制因子，其中AS通過抑制腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移達(dá)到抑制血管生成的目的，而ES可以對(duì)新腫瘤血管的生成造成干擾。本研究顯示，順鉑化療后ES、AS水平降低，VEGF水平升高，而采用痰熱清注射液輔助化療可抑制這種趨勢(shì)，進(jìn)而抑制新生血管生成，避免腫瘤快速生長(zhǎng)。

綜上所述，痰熱清注射液輔助化療可有效降低Lewis肺癌小鼠的腫瘤體積、增強(qiáng)免疫功能，可能是通過調(diào)節(jié)IL-2、TNF-α及IFN-γ等細(xì)胞因子的水平來調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能，通過抑制新生血管生長(zhǎng)來縮小腫瘤體積，然而其具體的作用機(jī)制還有待更為深入的研究。