林院 徐杰 羅奮棋 肖毓華

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院 福建省立醫(yī)院骨二科，福建 福州 350000)

成骨細(xì)胞引起的骨形成和破骨細(xì)胞引起的骨吸收是維持骨代謝平衡的關(guān)鍵節(jié)點，如果骨形成低于骨吸收，將引起骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)病及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)病等，反之將引起骨硬化病等疾病〔1,2〕。其中成骨細(xì)胞引起的骨形成是骨代謝平衡的關(guān)鍵點之一，此過程需要經(jīng)歷成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、礦化及凋亡等過程〔1,2〕。眾多信號通路與骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生密切相關(guān)，特別是Wnt、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)等信號通路，敲除了AKT會引起骨形成延遲，抑制此信號通路活性會導(dǎo)致成骨細(xì)胞增殖活性降低，因此，PI3K/AKT信號通路成為骨形成過程中關(guān)鍵信號調(diào)控通路〔3,4〕。丹酚酸B是從唇形科鼠尾草屬植物中提取出來的一種水溶性單體，具有顯著的抗血栓、抗氧化、改善微循環(huán)等藥理作用〔5,6〕；研究還顯示丹酚酸B具有骨代謝調(diào)控作用，能夠促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化〔7,8〕，對新生的小鼠成骨細(xì)胞增殖具有顯著的促進作用〔9〕，但是否能夠通過此PI3K/AKT信號通路調(diào)控成骨細(xì)胞骨形成尚未見報道。本課題組將對此展開探討。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株 小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2試劑與儀器 丹酚酸B購于中國藥品生物制品檢定所；改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清均購于美國Gibco公司；兔抗人堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(OPN)、Ⅰ型膠原蛋白(COLⅠ)、骨鈣素(OCN)、PI3K、AKT、磷酸化(p)-AKT及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體均購于美國Abcam公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、LY294002均購于南通碧云天生物技術(shù)有限公司。ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.3細(xì)胞分組 ①將0.00，0.01，0.03，0.10，0.30，1.00 nmol/L的丹酚酸B作用于MC3T3-E1細(xì)胞；②將細(xì)胞分為正常對照組(無任何藥物處理)，丹酚酸B組(0.10 nmol/L)，LY294002組(10 μmol/L的LY294002)，丹酚酸B+ LY294002組(0.10 nmol/L丹酚酸B+10 μmol/L LYP4002)。

1.4MTT法檢測MC3T3-E1細(xì)胞活力 將6×103個MC3T3-E1細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞貼壁后，按“1.3①”分組，并將細(xì)胞培養(yǎng)12、24、36 h，加入MTT孵育4 h后再加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶物溶解，測定吸光值。

1.5RT-PCR檢測ALP、OPN、COLⅠ、OCN mRNA的表達 采用Trizol法抽提取細(xì)胞總RNA。于紫外分光光度計上檢測總RNA在260或280 mm波長處的光吸收值(OD值)。通過一步法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后進行瓊脂糖凝膠電泳。ALP：正向:CTCGTTGACCACCTGGAAGAGCTTCAAACCG，反向:GGTCCGTCACGTTGTTCCTGTTCAGC；OPN：正向:CCAAGTAAGTCCAACGAAAG，反向:GGTGATGTCCTCGTCTGTA；COLⅠ：正向:AGGGCTCCAACGAGA-TCGAGATCCG，反向:TACAGGAAGCAGACAGGGCCAACGTCG；OCN：正向:CATGAGAGCCCTCACA，反向:AGAGCGACACCCTAGAC；GAPDH：正向:AGCCACATCGCTCAGACA，反向:TGGACTCCACGACGTACT。

1.6Western印跡檢測細(xì)胞中蛋白的表達 將9×103個MC3T3-E1細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞貼壁后，按“1.3”分組，并將細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并裂解得到細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。制作濃縮膠和分離膠，蛋白上樣后進行凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉封閉1 h后，一抗4℃過夜孵育，二抗室溫孵育1 h，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1丹酚酸B對MC3T3-E1細(xì)胞活力的影響 0.00、0.01、0.03、0.10、0.30、1.00 nmol/L丹酚酸B作用MC3T3-E1細(xì)胞12、24、36 h后，隨著作用時間延長，0.03、0.10、0.30 nmol/L丹酚酸B能顯著提高MC3T3-E1細(xì)胞活力(P<0.01)，0.01 nmol/L丹酚酸B對細(xì)胞活力影響不大，1.00 nmol/L丹酚酸B雖然能提高細(xì)胞活力(P<0.01)，但與0.10 nmol/L丹酚酸B比較促進程度較低。所以，本研究選擇0.03、0.10、0.30 nmol/L丹酚酸B作為MC3T3-E1細(xì)胞的給藥濃度。見表1。

2.2丹酚酸B對MC3T3-E1細(xì)胞ALP、OPN、COLⅠ及OCN mRNA表達的影響 0.00、0.03、0.10、0.30 nmol/L的丹酚酸B作用MC3T3-E1細(xì)胞12 h，與0.00 nmol/L比較，0.03、0.10、0.30 nmol/L 丹酚酸B能顯著上調(diào)ALP及OPN mRNA表達；各組丹酚酸B作用MC3T3-E1細(xì)胞24 h，與0.00 nmol/L比較，0.03、0.10、0.30 nmol/L能顯著上調(diào)COLⅠ及OCN mRNA表達量(P<0.01)。見表2。

表1 丹酚酸B對MC3T3-E1細(xì)胞活力的影響

與0 nmol/L的丹酚酸B比較:1)P<0.01；表2～4同

表2 丹酚酸B對MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、OPN、COLⅠ及OCN mRNA表達的影響

2.3丹酚酸B對MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、OPN、COLⅠ及OCN蛋白表達量的影響 0.00、0.03、0.10、0.30 nmol/L的丹酚酸B作用MC3T3-E1細(xì)胞12 h，與0.00 nmol/L比較，0.03、0.10、0.30 nmol/L 丹酚酸B能顯著上調(diào)ALP及OPN 蛋白表達；作用MC3T3-E1細(xì)胞24 h，與0.00 nmol/L比較，0.03、0.10、0.30 nmol/L能顯著上調(diào)COLⅠ及OCN蛋白表達量(P<0.01)。見表3。

2.4丹酚酸B對MC3T3-E1細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達量的影響 0.00、0.03、0.10、0.30 nmol/L的丹酚酸B作用MC3T3-E1細(xì)胞24 h，與0.00 nmol/L比較，0.03、0.10、0.30 nmol/L 丹酚酸B能顯著上調(diào)PI3K及p-AKT 蛋白表達。見表4。

表3 丹酚酸B對MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、OPN、COL Ⅰ及OCN 蛋白表達量的影響

表4 丹酚酸B對MC3T3-E1細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

2.5阻斷PI3K/AKT信號通路對丹酚酸B處理的MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、OPN、COLⅠ及OCN mRNA表達的影響 與正常對照組比較，丹酚酸B組ALP、OPN、COLⅠ、OCN mRNA表達量上調(diào)(P<0.01)，LY294002組ALP、OPN、COLⅠ、OCN mRNA表達量下調(diào)(P<0.01)。與LY294002組比較，丹酚酸B+ LY294002組ALP、OPN、COLⅠ、OCN mRNA表達量上調(diào)(P<0.01)。見表5。

2.6阻斷PI3K/AKT信號通路對丹酚酸B處理的MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、OPN、COLⅠ及OCN 蛋白表達的影響 與正常對照組比較，丹酚酸B組ALP、OPN、COLⅠ、OCN mRNA表達量上調(diào)(P<0.01)，LY294002組ALP、OPN、COLⅠ、OCN 蛋白表達量下調(diào)(P<0.01)。與LY294002組比較，丹酚酸B+ LY294002組ALP、OPN、COLⅠ、OCN 蛋白表達量上調(diào)(P<0.01)。見表6。

2.7阻斷PI3K/AKT信號通路對丹酚酸B處理的MC3T3-E1細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 與正常對照組比較，丹酚酸B組PI3K及p-AKT蛋白表達量上調(diào)(P<0.01)，LY294002組PI3K及p-AKT蛋白表達量下調(diào)(P<0.01)。與LY294002組比較，丹酚酸B+ LY294002組PI3K及p-AKT蛋白表達量上調(diào)(P<0.01)。見表6。

表5 阻斷PI3K/AKT信號通路對丹酚酸B處理的MC3T3-E1細(xì)胞ALP、OPN、COL Ⅰ及OCN mRNA表達的影響

與正常對照組比較：1)P<0.01；與LY294002組比較：2)P<0.01；下表同

表6 阻斷PI3K/AKT信號通路對丹酚酸B處理的MC3T3-E1細(xì)胞ALP、OPN、COLⅠ及OCN 蛋白、PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

3 討 論

丹參又稱為赤參、紅根、是唇形科鼠尾草屬植物中的一種傳統(tǒng)中藥，具有活血止痛祛瘀消癰等功效，常被用于心腦血管疾病的治療當(dāng)中〔5，6〕。目前從丹參中提取了眾多有效單體成分，包括丹參素、丹酚酸B等水溶性成分，丹參酮、隱丹參酮等脂溶性成分，其中作為丹參有效成分的丹酚酸B，是丹參水溶性成分中含量及活性成分較高的單體，除了顯著的心血管藥理作用外，還能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化，同時還具有骨代謝調(diào)控作用〔5，6〕。如Luo等〔7〕研究顯示丹酚酸B能夠刺激地塞米松誘導(dǎo)的斑馬魚幼體向成骨細(xì)胞分化并基質(zhì)礦化；Zhang等〔8〕研究證實丹參有效單體成分丹酚酸B通過一氧化氮(NO)途徑誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化；范煥瓊等〔9〕研究顯示丹參酸B能夠顯著刺激成骨細(xì)胞增殖；劉鈺瑜等〔10〕研究表明丹酚酸B能夠通過抑制地塞米松引起的MC3T3-E1細(xì)胞中DKK1 mRNA表達進而促進細(xì)胞骨形成，最終發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松作用。而丹酚酸B對成骨細(xì)胞骨形成作用機制尚不明確。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.03、0.10、0.30 nmol/L丹酚酸B能顯著提高MC3T3-E1細(xì)胞活力，0.01 nmol/L丹酚酸B對細(xì)胞活力影響不大，1.00 nmol/L丹酚酸B雖然能提高細(xì)胞活力，但與0.10 nmol/L丹酚酸B比較促進程度較低，所以本研究選擇0.03、0.10、0.30 nmol/L丹酚酸B作為MC3T3-E1細(xì)胞的給藥濃度，此劑量濃度范圍與以往研究一致〔9，10〕。ALP是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志物，是成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)礦化的啟動因子。OPN是成骨細(xì)胞中期分化標(biāo)志物，是基質(zhì)礦化的調(diào)節(jié)基因，能夠調(diào)控成骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，并促進羥基磷灰石形成，成骨細(xì)胞礦化并骨形成。COLⅠ是成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)礦化的主要支架，促進成骨細(xì)胞的黏附及分化。OCN是中晚期成骨細(xì)胞形成的標(biāo)志物，通過與鈣及羥基磷灰石結(jié)合促進骨形成。因此，本研究結(jié)果提示丹酚酸B能夠通過促進骨形成相關(guān)蛋白表達進而刺激MC3T3-E1成骨細(xì)胞骨形成。

PI3K/AKT信號通路是一種廣泛存在于多種組織中的與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在受到上游生長因子刺激后，PI3K被激活，激活后的PI3K產(chǎn)物磷脂酰肌醇三磷酸能夠結(jié)合于AKT，使AKT由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，同時構(gòu)象發(fā)生變化，繼而引起AKT絲氨酸和蘇氨酸位點發(fā)生磷酸化，活化后的AKT能夠進一步激活下游靶蛋白，參與細(xì)胞的生長、分化等過程〔11〕。近些年來已發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路及其下游靶蛋白在骨形成及骨重建過程中發(fā)揮重要作用〔3，4〕。敲除AKT后會引起小鼠骨化延遲〔3，4〕。在MC3T3-E1細(xì)胞中加入LY294002會降低細(xì)胞活性，同時使Omentin-1，BMP-2、4、5等誘導(dǎo)劑對成骨細(xì)胞骨形成的刺激作用減弱甚至消失〔12，13〕。另外，丹酚酸B能夠通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路保護急性大鼠腎損傷、三氯化物引起的心肌細(xì)胞損傷〔14，15〕，提示丹酚酸B對PI3K/AKT信號通路具有顯著的調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明丹酚酸B能顯著上調(diào)PI3K及p-AKT表達。同時，本研究為了進一步證實丹酚酸B是通過PI3K/AKT信號通路刺激成骨細(xì)胞骨形成，采用PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002與丹酚酸B共同作用MC3T3-E1細(xì)胞，結(jié)果表明LY294002能顯著減弱MC3T3-E1細(xì)胞中骨形成相關(guān)基因(ALP、OPN、COL Ⅰ及OCN)的表達，同時還抑制了丹酚酸B對PI3K及p-AKT表達的上調(diào)作用，從而說明丹酚酸B確實是通過激活PI3K/AKT信號通路進而刺激MC3T3-E1細(xì)胞骨形成。

綜上，0.03、0.10、0.30 nmol/L丹酚酸B能顯著提高MC3T3-E1細(xì)胞活力，上調(diào)ALP、OPN、COLⅠ及OCN表達，進而刺激成骨細(xì)胞骨形成，此過程是通過激活PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)的。