王芳蘭 李玉山 崔彥虎

(1平?jīng)鍪械诙嗣襻t(yī)院婦產(chǎn)科，甘肅 平?jīng)?744000；2涼州中醫(yī)醫(yī)院普外科；3平?jīng)鍪腥嗣襻t(yī)院麻醉科)

卵巢癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，每年有超過20萬的新增卵巢癌患者，其臨床表現(xiàn)較為隱匿，病理類型較為復(fù)雜，有超過50%的患者在確診時已經(jīng)處于卵巢癌晚期，手術(shù)治療、化療、基因靶向治療等是目前常見的卵巢癌的治療手段，尋找有效的靶基因提高卵巢癌對化療藥物的敏感性是目前研究的熱點〔1〕。誘騙受體(DCR)3是一種腫瘤壞死因子的受體，在人體的胚胎、肝臟等組織中表達水平較低，可以調(diào)控細胞的分化、生長、凋亡等過程，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔2，3〕。研究顯示，DCR3在多種腫瘤組織如肺癌、胃癌等中過度表達，參與腫瘤細胞生長過程〔4～6〕。本實驗通過慢病毒干擾下調(diào)卵巢癌細胞中DCR3的表達，探討沉默DCR3對卵巢癌細胞生長凋亡及紫杉醇敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1材料 卵巢癌細胞ES-2購自BNCC細胞庫；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(C-Caspase)-12抗體、DCR3抗體購自加拿大PLLABS；RNA提取試劑盒購自北京solarbio；綠色熒光蛋白(GFP)靶向DCR3慢病毒干擾載體由上海銳賽生物技術(shù)有限公司構(gòu)建；紫杉醇購自美國Caibioclem；Realtime PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；C-Caspase-3、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)抗體購自美國ABCM。

1.2紫杉醇對卵巢癌細胞增殖影響 ES-2細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)液中添加1%的青鏈霉素，細胞培養(yǎng)條件為：飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱，溫度為37℃。ES-2細胞種植到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔中加入3 000個細胞，培養(yǎng)過夜以后，將培養(yǎng)液吸除，加入含有0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L紫杉醇的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h以后，將細胞培養(yǎng)板取出，在每孔內(nèi)加入10 μl的細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)，放在37℃結(jié)合4 h。用酶標(biāo)儀檢測450 nm的OD值。以不含細胞的空白孔調(diào)零以后，把0 mol/L紫杉醇處理的細胞存活率計為100%，分析不同濃度紫杉醇處理后卵巢癌細胞存活率變化。

1.3細胞轉(zhuǎn)染和分組 ES-2細胞培養(yǎng)至對數(shù)期以后，用胰蛋白酶消化，種植到6孔板內(nèi)，細胞融合度為30%時進行慢病毒感染，在細胞中添加感染復(fù)數(shù)(MOI)=20的病毒液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換成新鮮的細胞培養(yǎng)液。3 d后，在熒光顯微鏡下觀察慢病毒載體上GFP熒光表達水平，感染效率高于80%繼續(xù)培養(yǎng)。將穩(wěn)定感染靶向DCR3慢病毒干擾載體和對照載體的ES-2細胞記為干擾組、對照組，用Realtime PCR和Western印跡檢測干擾效果。把給予10-6mol/L紫杉醇處理穩(wěn)定感染靶向DCR3慢病毒干擾載體和對照載體的ES-2細胞記為紫杉醇組、紫杉醇+干擾組。

1.4Realtime PCR檢測DCR3表達水平 取對照組、干擾組，按照RNA提取試劑盒說明書將細胞中的總RNA分別提取，在-80℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄酶進行cDNA合成，步驟同試劑盒說明書，cDNA保存在-80℃。Realtime PCR試劑盒分析DCR3水平，讀取內(nèi)參β-actin和目的基因DCR3的Ct值，按照2-△△CT計算。Realtime PCR程序設(shè)置：94℃，5 min(94℃，30 s；60℃，30 s；72℃，10 min)×40個循環(huán)。引物序列如下：DCR3上游5′-CTCTTCCTCCCATGACAC-3′，下游5′-CTGGA-AAGCCACAAAGTC-3′。β-actin上游5′-CGTGAAA-AGATGACCCAGATCA-3′，下游5′-CAGCCTGGATGGCTACGTACA-3′。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5Western印跡檢測DCR3表達水平 取對照組、干擾組，常規(guī)方法提取細胞中的蛋白，蛋白分裝后保存在-20℃。以二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒測定各組蛋白樣品的濃度。按照每個上樣孔中加入30 μg蛋白進行電泳，上樣前同1/4體積的5倍上樣緩沖液混合后，在100℃煮沸5 min。十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中電壓為：濃縮膠中72 V，觀察溴酚藍到達分離膠和濃縮膠交接處后，將電壓調(diào)高至120 V繼續(xù)電泳，直到觀察溴酚藍進入膠塊下端邊緣約1 cm時，停止電泳。凝膠在80 V電壓條件下轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜置于冰水混合物上進行，轉(zhuǎn)膜時間為90 min。用5%的牛血清白蛋白將電轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素(NC)膜封閉以后，同1∶500倍稀釋后的DCR3抗體在4℃過夜反應(yīng)，再與1∶2 000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗在室溫孵育2 h后，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色，檢測各組目的蛋白DCR3和內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值，以二者的比值表示DCR3蛋白水平。

1.6細胞克隆實驗檢測細胞克隆形成能力 對照組、干擾組、紫杉醇組、紫杉醇+干擾組按照上述方法處理后，按照每個孔內(nèi)加200個細胞接種至6孔板，培養(yǎng)14 d，期間每3 d進行換液1次。把孔內(nèi)的液體吸除以后，以多聚甲醛固定以后，滴加吉姆薩染液，染色20 min。觀察計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)目，以細胞克隆數(shù)目占接種細胞數(shù)目的百分比作為克隆形成率。按照對照組、干擾組、紫杉醇組、紫杉醇+干擾組分組處理細胞，用CCK-8法檢測細胞48 h增殖情況，步驟同1.2。

1.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 對照組、干擾組、紫杉醇組、紫杉醇+干擾組按照上述方法處理后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化，用磷酸鹽緩沖液(PBS)制成單細胞懸浮液，離心后，棄上清，添加200 μl結(jié)合緩沖液懸浮各組細胞，加入碘化丙啶(PI)、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC各5 μl，置于流式細胞儀上檢測各組細胞凋亡變化。

1.8Western印跡檢測細胞中C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平 對照組、干擾組、紫杉醇組、紫杉醇+干擾組按照上述方法處理后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以Western印跡方法測定細胞中C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平，C-Caspase-12、C-Caspase-3抗體以1∶400稀釋，CHOP抗體以1∶200稀釋。步驟同1.5。

1.9統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1紫杉醇抑制卵巢癌細胞增殖 紫杉醇濃度：0 mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的細胞存活率分別為100.00%、(90.15±7.86)%、(76.82±6.38)%、(53.26±4.15)%、(34.15±2.17)%。不同濃度紫杉醇處理后的卵巢癌細胞的存活率逐漸降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，10-6mol/L的紫杉醇處理后的卵巢癌細胞存活率約為50%，后續(xù)選用10-6mol/L的紫杉醇處理卵巢癌細胞。

2.2慢病毒感染效果檢測結(jié)果 與對照組比較，干擾組細胞中DCR3 mRNA和蛋白水平均顯著降低(均P<0.05)。構(gòu)建了DCR3表達下調(diào)的卵巢癌細胞。見表1，圖1。

表1 兩組DCR3 mRNA和蛋白水平比較

與對照組比較：1)P<0.05

圖1 Western印跡檢測DCR3表達

2.3各組細胞存活率及克隆形成率比較 與對照組比較，干擾組、紫杉醇組及紫杉醇+干擾組細胞存活率及克隆形成率均顯著降低(P<0.05)。與紫杉醇組比較，紫杉醇+干擾組細胞存活率及克隆形成率均顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.4各組細胞凋亡率比較 與對照組〔(6.23±0.52)%〕比較，干擾組、紫杉醇組及紫杉醇+干擾組細胞凋亡率均顯著升高〔(24.15±2.13)%、(32.52±2.89)%、(46.10±3.27)%；均P<0.05〕。與紫杉醇組比較，紫杉醇+干擾組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2。

表2 各組卵巢癌細胞存活率和細胞克隆形成率

與對照組比較：1)P<0.05；與紫杉醇組比較：2)P<0.05；下表同

圖2 流式細胞術(shù)測定各組細胞凋亡率

2.5各組C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白表達比較 與對照組比較，干擾組、紫杉醇組及紫杉醇+干擾組C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平顯著升高(均P<0.05)；與紫杉醇組比較，紫杉醇+干擾組C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 Western印跡檢測C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平

表3 各組C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平比較

3 討 論

DCR3基因定位在人類的20q13.3染色體上，該染色體上多個基因的擴增與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，DCR3在胃、脊髓、脾臟等組織中廣泛低表達，而在腫瘤中過度表達〔7，8〕。DCR3基因的cDNA編碼的蛋白質(zhì)含有300多個氨基酸，其N端含有一個信號肽序列，在信號肽序列之后有4個富含半胱氨酸的區(qū)域，其在細胞增殖、凋亡等中具有重要作用〔9〕。目前在肺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)DCR3過度表達，并且沉默其表達后還可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，下調(diào)腫瘤細胞的增殖能力〔10～12〕。DCR3在卵巢癌組織中過表達，其表達水平的高低與腫瘤患者年齡等無關(guān)，與腫瘤患者的臨床分期、組織分化程度等有關(guān)，DCR3可能是卵巢癌治療的潛在靶點〔13，14〕。本研究顯示，沉默DCR3后的卵巢癌細胞增殖能力和細胞克隆能力均降低，說明沉默DCR3發(fā)揮卵巢癌細胞生長抑制作用，這與上述研究類似，均表明沉默DCR3抑制腫瘤細胞生長。

紫杉醇主要是從紅豆杉屬植物中分離出來的一種二萜類化合物，目前廣泛用于乳腺癌、卵巢癌等十幾種腫瘤的臨床治療中〔15，16〕。紫杉醇具有較好的抗腫瘤效果，其可以通過抑制細胞的有絲分裂、誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用〔17〕。靶向基因增加紫杉醇敏感性是目前研究的重點，也是提高腫瘤治愈率的重要途徑〔18〕。本實驗結(jié)果表明，紫杉醇處理后的卵巢癌細胞的增殖和克隆形成能力降低，同時細胞凋亡水平升高，說明紫杉醇具有在體外抑制卵巢癌細胞的作用，同時本實驗還發(fā)現(xiàn)，靶向DCR3沉默后的卵巢癌經(jīng)紫杉醇處理后，細胞凋亡率進一步升高，細胞增殖能力下降更多，說明靶向DCR3沉默可以在體外提高卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性，DCR3可能是提高卵巢癌紫杉醇敏感性的潛在靶點。

細胞凋亡是細胞主動死亡的過程，其發(fā)生機制較為復(fù)雜，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是近年來發(fā)現(xiàn)的一種凋亡途徑〔19〕。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)膽固醇等合成、折疊的重要場所，蛋白質(zhì)正確折疊是保證細胞正常功能發(fā)揮的重要途徑，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到外界因素的刺激以后，細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白CHOP大量表達，誘導(dǎo)Caspase-12活化，引起細胞凋亡發(fā)生〔20～22〕。Caspase-12定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的外膜，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中被激活，而與其他凋亡途徑無關(guān)〔23～25〕。本實驗結(jié)果顯示，沉默DCR3后的卵巢癌細胞經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)以后，細胞中Caspase-12的活化水平升高，細胞中CHOP蛋白含量升高，同時細胞中凋亡標(biāo)志蛋白Caspase-3的活化水平也升高，提示靶向DCR3協(xié)同紫杉醇通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡。

綜上，靶向DCR3可能是提高卵巢癌紫杉醇敏感性的途徑之一，其可以協(xié)同紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡，抑制卵巢癌細胞生長，這為提高腫瘤化療敏感性提供了新思路，對于提高卵巢癌患者治愈率具有重要意義。本實驗只在1株卵巢癌細胞中進行了初步探討，后續(xù)會在多株細胞中進行驗證，并且會對其具體的作用機制進行探索。