陳曉娟 李巍 張旭亮

(浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 杭州 310058)

阿爾茨海默病(AD)是一種以認(rèn)知功能進(jìn)行性下降和情感障礙為特點(diǎn)的神經(jīng)退行性疾病〔1〕，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。AD的臨床特征主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力減退、認(rèn)知功能下降、語言障礙、精神行為異常等神經(jīng)精神癥狀〔2〕。α7煙堿型膽堿能受體(α7nAChR)是乙酰膽堿調(diào)控的配體門控離子通道蛋白，由5個(gè)α7亞基構(gòu)成的同型五聚體，每個(gè)亞基由502個(gè)氨基酸組成。α7nAChR主要分布在海馬、皮層等與記憶和認(rèn)知相關(guān)區(qū)域〔3〕，對鈣離子有相當(dāng)高的通透性，能調(diào)節(jié)鈣的濃度及乙酰膽堿遞質(zhì)的釋放〔4〕。α7nAChR與認(rèn)知、記憶、疼痛、神經(jīng)保護(hù)和炎癥密切相關(guān)，被認(rèn)為是潛在的治療AD、帕金森病和炎癥性疾病的作用靶點(diǎn)〔5～7〕。 本研究利用最新的基因修飾技術(shù)——CRISPR/Cas9系統(tǒng)〔8〕制備了α7nAChR基因敲除小鼠，為進(jìn)一步系統(tǒng)研究α7nAChR的功能提供動(dòng)物模型，并為探索α7nAChR在AD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用積累必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6和ICR小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。小鼠飼養(yǎng)在浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境，12/12 h明暗交替，室溫22～26℃，濕度40%～60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作符合浙江大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。

1.2主要試劑 pGL3-U6-sgRNA和Cas9表達(dá)載體均由浙江大學(xué)轉(zhuǎn)基因平臺(tái)提供；T克隆試劑盒、T4連接酶、Bsa I酶購自takara公司，DNA標(biāo)記(Marker)購自Thermo公司；PCR mix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成、基因測序均由上海生物工程公司完成。

1.3sgRNA靶點(diǎn)的選擇及sgRNA、Cas9體外轉(zhuǎn)錄 Chrnα7基因位于7號(hào)染色體，蛋白編碼502個(gè)氨基酸，共有10個(gè)外顯子。應(yīng)用http：//crispr.mit.edu網(wǎng)站與文獻(xiàn)〔9〕進(jìn)行分析，針對α7nAChR基因內(nèi)顯子(intron)3和intron4設(shè)計(jì)兩條sgRNA(見圖1)，引導(dǎo)Cas9核酸酶定點(diǎn)發(fā)生剪切，外顯子(exon)4片段敲除，導(dǎo)致基因讀碼框發(fā)生移碼突變，引發(fā)無義介導(dǎo)mRNA降解(NMD)效應(yīng)，最終使蛋白功能缺失。經(jīng)活性檢測，確定序列為sgRNA1 (5′-3′)：CCATGACCACATTTGTATGA和sgRNA2 (5′-3′)：TGGTATTTGCATCGAAGTTC。

圖1 sgRNA序列設(shè)計(jì)示意圖

1.4顯微注射及其受精卵移植 將Cas9 mRNA和α7nAChR sgRNA混合后，顯微注射到原核清晰的C57受精卵中，再將胚胎移植入供體ICR母鼠輸卵管內(nèi)。

1.5F0代敲除小鼠基因型鑒定及擴(kuò)群繁育 對F0代小鼠的基因型進(jìn)行鑒定，PCR反應(yīng)的引物：上游引物GGCTAGAAGTAACCAGTCCAT，下游引物CTGCTTCAAGAGTGCTTCATAT。將鑒定結(jié)果敲除陽性的F0代小鼠與C57BL/6J小鼠回交，獲得穩(wěn)定遺傳的F1代雜合子。再通過F1自交，將獲得F2代進(jìn)行基因型鑒定后，選出α7nAChR基因敲除純合子擴(kuò)群繁殖后，進(jìn)行后續(xù)的行為學(xué)測試。

1.6小鼠行為學(xué)測試 3月齡α7nAChR敲除(KO)雄鼠13只和野生型(WT)雄鼠12只，進(jìn)行焦慮樣行為和學(xué)習(xí)記憶能力分析，共4個(gè)行為學(xué)測試項(xiàng)目。曠場試驗(yàn)主要測試小鼠的焦慮程度和自主活動(dòng)能力，對活動(dòng)距離、活動(dòng)速度和中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間進(jìn)行分析。高架十字迷宮試驗(yàn)利用動(dòng)物對新環(huán)境的探索性和對高懸開臂的恐懼，測試動(dòng)物在復(fù)雜環(huán)境中的自主活動(dòng)能力和焦慮程度。動(dòng)物進(jìn)入開臂的次數(shù)和在開臂滯留時(shí)間越長，說明動(dòng)物的自主活動(dòng)能力越高，而焦慮程度越低。水迷宮試驗(yàn)包括定向航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)。條件性恐懼反射系統(tǒng)是基于巴普洛夫條件反射而建立的一種經(jīng)典的誘導(dǎo)焦慮反應(yīng)模型的方法。動(dòng)物在恐懼時(shí)會(huì)表現(xiàn)出特有的僵直不動(dòng)狀態(tài)(Freezing)，僵直時(shí)間百分比越高，表示越焦慮。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、重復(fù)測量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1sgRNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果 根據(jù)α7nAChR基因intron3和intron4靶序列信息設(shè)計(jì)sgRNA，結(jié)果顯示，體外轉(zhuǎn)錄sgRNA和Cas9成功，電泳圖見圖2。

圖2 體外轉(zhuǎn)錄sgRNA和Cas9電泳結(jié)果

2.2F0代小鼠基因型鑒定及擴(kuò)群繁育 陽性F0代小鼠α7nAChR基因在第四exon有531 bp片段敲除，見圖3。選取陽性F0代小鼠與WT C57BL/6J小鼠回交，獲得穩(wěn)定遺傳的F1代雜合子，F(xiàn)1自交獲得F2代小鼠的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因型鑒定，PCR鑒定電泳圖見圖4。根據(jù)結(jié)果選取 α7nAChR KO純合子進(jìn)行擴(kuò)繁。

2.3行為學(xué)測試結(jié)果

2.3.1曠場試驗(yàn) KO組與WT組運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)速度、中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

圖3 F0代陽性小鼠基因序列突變

1:純合子；2:純合子；3:雜合子；4:雜合子；5:野生型；6:野生型；7:DNA marker 圖4 F2小鼠基因鑒定電泳

表1 曠場實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果

2.3.2高架十字迷宮試驗(yàn) KO小鼠進(jìn)入開臂的時(shí)間〔(45.24±6.63)s〕少于WT小鼠〔(53.63±7.94)s〕，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.3水迷宮試驗(yàn) KO組與WT組在定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表2 水迷宮測試結(jié)果

2.3.4條件性恐懼反射系統(tǒng)試驗(yàn) KO組僵直時(shí)間百分比高于WT組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 條件性恐懼記憶測試結(jié)果

3 討 論

AD主要病理特征是神經(jīng)元外周β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積引發(fā)的炎性斑點(diǎn)〔10〕。研究證實(shí)，AD患者膽堿能神經(jīng)元明顯減少，且α7nAChR在大腦皮質(zhì)和海馬部位顯著下降。Aβ拮抗α7nAChR引起的細(xì)胞毒性可以用α7nAChR激動(dòng)劑緩解〔11〕。臨床試驗(yàn)證明，α7nAChR激動(dòng)劑能改善AD患者的認(rèn)知障礙、學(xué)習(xí)記憶能力〔12〕。AD的病因及其致病機(jī)制尚不明確，利用最新的基因修飾技術(shù)，在活體上研究某一特定相關(guān)基因的作用，可為AD研究提供理想的動(dòng)物模型。

本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)，利用非同源重組修復(fù)引入突變的方式，敲除α7nAChR基因第四exon 531 bp片段，成功構(gòu)建α7nAChR基因敲除小鼠，為α7nAChR的研究奠定了基礎(chǔ)，為α7nAChR在AD疾病中的作為提供了小鼠模型。83只F0代中僅獲得了1雄1雌2只基因敲除小鼠，雌鼠因與WT雄鼠回交未產(chǎn)仔而淘汰；雄鼠與WT雌鼠交配獲得實(shí)驗(yàn)所需的F1代雜合子。分析本研究中敲除效率低的可能原因有α7nAChR sgRNA和Cas9 mRNA的濃度比例未優(yōu)化，顯微注射不熟練導(dǎo)致的RNA降解等。

年齡的增長是AD最大的風(fēng)險(xiǎn)因素，大腦的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)隨著年齡增長發(fā)生變化，但AD導(dǎo)致衰老還是衰老導(dǎo)致AD依然存在爭執(zhí)〔13〕。膜片鉗電生理技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與同齡的WT小鼠相比，22～24月齡AD模型鼠在海馬CA3～CA1區(qū)域顯著降低了突觸傳遞和長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)受損〔14〕。小鼠的壽命1～3年，一般雄鼠45～60日齡性成熟，體成熟為70～80日齡〔15〕，24月齡可認(rèn)為是老年鼠。成年敲除動(dòng)物是否已出現(xiàn)AD尚無報(bào)道。根據(jù)C57BL/6J小鼠特性和神經(jīng)退行性疾病行為學(xué)測試一般方法〔16，17〕，本研究選取了3月齡的成年α7nAChR KO雄鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證未衰老的α7nAChR KO鼠有無AD表征。行為學(xué)測試結(jié)果顯示，α7nAChR KO鼠學(xué)習(xí)記憶能力正常，但表現(xiàn)出開臂區(qū)活動(dòng)時(shí)間短和恐懼時(shí)僵直時(shí)間比高等焦慮樣行為趨勢，從而推測，AD可能于成年時(shí)已經(jīng)表現(xiàn)出部分病癥。具體出現(xiàn)的時(shí)間，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)。