陳智 劉玉珍 齊博 劉尚國 趙寶生

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1第一附屬醫(yī)院胸外科二病區(qū)，河南 衛(wèi)輝 453100；2食管癌研究所；3河南省神經(jīng)病學(xué)研究所)

根據(jù)臨床病理分型，我國食管癌多以鱗狀細胞癌為主〔1〕。食管癌具有高度侵襲性且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的主要方式。EMT即上皮細胞間質(zhì)化，是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞并獲得遷移和侵襲能力的生物學(xué)過程〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，micro RNA(miR)異常表達參與腫瘤生物學(xué)進展〔3〕。人miR-212(has-miR-212)具有組織特異性，在不同腫瘤組織中表現(xiàn)為抑癌或促癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織標本中miR-212表達水平升高與術(shù)后轉(zhuǎn)移早、生存期短、預(yù)后不良顯著相關(guān)〔4，5〕；另外，雷帕霉素等特定信號通路抑制劑無法阻斷食管癌中miR-212高表達介導(dǎo)的促進腫瘤轉(zhuǎn)移的表型。中藥提取物小檗堿對食管癌細胞具有抗增殖、促凋亡、抑制遷移的作用〔6〕。二甲雙胍不僅能夠治療糖尿病，其廣譜的抗腫瘤活性〔7〕在其他腫瘤中已有報道。因此，本文旨在進一步探討具有廣譜抗腫瘤作用的小檗堿與二甲雙胍聯(lián)合用藥對miR-212介導(dǎo)的食管癌細胞遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1材料 人食管癌KYSE-450細胞購自南京科佰生物技術(shù)有限公司。新生胎牛血清(FBS)購自Clark；RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)購自Corning；胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素、鏈霉素購自索萊寶科技有限公司；小檗堿購自上海源葉生物有限公司；二甲雙胍購自碧云天生物技術(shù)有限公司。人成熟型miR-212過表達慢病毒載體由上海吉瑪基因生物公司合成。單克隆兔抗E-cadherin、Vimentin、Twist1、GAPDH購自CST公司。二喹林甲酸(BCA)試劑盒、辣根過氧化物酶標記的兔抗免疫球蛋白(Ig)G抗體購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2藥物配置 小檗堿用DMSO溶解，配置成50 mmol/L的貯存液，-20℃保存，使用前解凍，并用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋到相應(yīng)的工作濃度。二甲雙胍用PBS配備，制成1 mol/L的貯存液，使用前根據(jù)實驗所需濃度用PBS進行稀釋。

1.3細胞培養(yǎng) 使用含有10%FBS和100 U青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、飽和濕潤空氣、體積分數(shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。待細胞融合至70%～80%，用胰酶消化處理后，計數(shù)傳代。

1.4慢病毒轉(zhuǎn)染 選取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。2×105個KYSE-450細胞于轉(zhuǎn)染前24 h接種在6孔板中。根據(jù)上海吉瑪基因的細胞轉(zhuǎn)染說明書進行實驗操作，并用5 mg/ml的嘌呤霉素對轉(zhuǎn)染細胞進行篩選，從中篩選出能夠穩(wěn)定高表達miR-212的KYSE-450細胞用于后續(xù)實驗。

1.5Transwell實驗 檢測藥物處理后對細胞遷移的影響 按Transwell說明書操作：①取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)胰酶消化成單個懸浮細胞后，用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)；②向Transwell小室的上室內(nèi)加入細胞懸液(含1×105個細胞)，加入無血清的RPMI1640稀釋至200 μl；③下室加入600 μl含10% FBS的完全培養(yǎng)基，另外上室和下室中按比例加入稀釋過的藥物；④置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出小室；⑤將小室浸入4%多聚甲醛中固定15 min，結(jié)晶紫染色8 min，晾干，并吸走小室內(nèi)的液體，用棉棒將上室內(nèi)的細胞擦去；⑥每個培養(yǎng)孔隨機選5個視野，置于熒光顯微鏡下進行拍照，并計算各視野下的細胞數(shù)，每組實驗重復(fù)3次。

1.6Western印跡法檢測藥物處理后EMT相關(guān)蛋白的表達 將處于對數(shù)生長期的細胞按照上述分組進行處理48 h，用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解細胞后提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度(根據(jù)BCA試劑盒說明書進行操作)。以每組30 μg的等量蛋白樣品上樣，用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，再用5%的脫脂奶粉在常溫下封閉1 h，加入E-cadherin、Vimentin、Twist1(1∶1 000)等一抗4℃過夜，用TBST洗膜后(10 min×3次)，加入辣根過氧化物酶標記兔抗IgG(1∶8 000)室溫搖床上孵育1 h，再洗膜30 min，除去未結(jié)合的二抗，最后根據(jù)說明書按照1∶1配置電化學(xué)發(fā)光(ECL)工作液，用凝膠成像儀成像。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1小檗堿、二甲雙胍對miR-212介導(dǎo)的KYSE-450細胞遷移的影響 與對照組比，過表達miR-212后促進了細胞遷移能力(P<0.05)。不同濃度小檗堿(10 μmol/L和20 μmol/L)作用于過表達miR-212的KYSE-450細胞后，與miR-212組(未加藥處理)相比，呈濃度-劑量依賴性出現(xiàn)抑制細胞遷移能力的作用(P<0.001)。給予10 mmol/L和20 mmol/L二甲雙胍處理后，與miR-212組(未加藥處理)相比，其抑制作用具有濃度-劑量依賴性，隨濃度增加抑制作用逐漸明顯(P<0.001)。見圖1、2，表1。

圖1 小檗堿對過表達miR-212的KYSE-450細胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

圖2 二甲雙胍對過表達miR-212的KYSE-450細胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.2小檗堿和二甲雙胍聯(lián)合對miR-212介導(dǎo)的KYSE-450細胞遷移的影響 過表達miR-212的KYSE-450細胞遷移細胞數(shù)〔(555.67±5.69)個〕顯著高于對照組〔(363.67±5.13)個，P<0.05)〕。 miR-212+10 μmol/L小檗堿組細胞遷移細胞數(shù)〔(419.32±4.00)個〕和miR-212+10 mmol/L二甲雙胍組細胞遷移細胞數(shù)〔(504.27±5.29)個〕均顯著低于對照組，且顯著高于miR-212+10 μmol/L小檗堿+10 mmol/L二甲雙胍組〔(197.36±5.57)個〕，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

表1 小檗堿、二甲雙胍對過表達miR-212的KYSE-450細胞遷移的影響個，n=3)

與對照組比較：1)P<0.05；與miR-212組(未加藥處理)比較：2)P<0.05；下表同

圖3 小檗堿和二甲雙胍聯(lián)合對miR-212介導(dǎo)的KYSE-450細胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.3Western印跡法檢測藥物處理后E-cadherin、Vimentin、Twist1蛋白水平 與對照組相比，過表達miR-212組(未加藥處理)E-cadherin表達下調(diào)(P<0.05)，Vimentin、Twist1表達上調(diào)(P<0.05)；兩種藥物聯(lián)合處理后，與過表達miR-212組(未加藥處理)相比，E-cadherin表達明顯增加，Vimentin、Twist1的表達顯著下降(P<0.05)，見表2、圖4。

表2 Western印跡法檢測小檗堿和二甲雙胍對EMT相關(guān)蛋白表達的影響

圖4 Western印跡法檢測小檗堿和二甲雙胍處理后對EMT相關(guān)蛋白的表達情況

3 討 論

腫瘤獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力的重要標志是發(fā)生EMT。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞發(fā)生EMT后，癌細胞之間的黏附性下降，發(fā)生解離，上皮細胞獲得間充質(zhì)細胞的表型并由此增加遷移和侵襲的能力〔8〕。文獻報道，miRNA與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)〔9〕。miRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA分子，并參與細胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等一系列重要的生物學(xué)過程〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的表達水平對EMT發(fā)生有促進或抑制作用〔11〕。miR-212定位于染色體17p13.3上，參與多種腫瘤的生物學(xué)進展。如在胰腺癌中miR-212表達上調(diào)作為促癌基因參與腫瘤發(fā)展〔12〕；相反，miR-212在肝細胞癌中表達下調(diào)作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用〔13〕。本研究顯示miR-212的高表達水平能夠促進食管癌細胞的遷移和侵襲能力。因此，通過miRNA調(diào)節(jié)并干預(yù)食管癌細胞的生物學(xué)進展，找到具有治療潛力的miRNA的靶點藥物，能夠提高食管癌臨床治療手段。

前期研究顯示，給予LY294002(磷脂酰肌醇三激酶抑制劑)、雷帕霉素(靶蛋白抑制劑)等腫瘤相關(guān)經(jīng)典信號通路抑制劑，不能抑制miR-212介導(dǎo)的促進食管癌細胞遷移的能力。因此推測，miR-212過表達能夠激活下游多條信號通路，從而促進EMT轉(zhuǎn)化過程。

小檗堿又名黃連素，具有抗炎、抗菌、抗糖尿病等〔14,15〕作用。二甲雙胍能夠抑制食管癌〔16〕、乳腺癌〔17〕等腫瘤細胞的生長，其潛在的廣譜抗腫瘤活性也被廣泛研究。腫瘤的聯(lián)合用藥是指利用不同藥物之間的協(xié)同作用以取得比單一藥物更好的效果〔18〕，通過減低藥物劑量達到減少藥物毒副作用目的，并增強藥物療效，有效抑制腫瘤生長，防止腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔19〕。將廣譜抗腫瘤藥物小檗堿和二甲雙胍聯(lián)合用藥，能有效地提高抗腫瘤藥物的活性，達到抑制腫瘤細胞生長的目的。

本實驗表明，低劑量的小檗堿、二甲雙胍單獨處理miR-212過表達的KYSE-450細胞，未能有效抑制細胞遷移能力；將二者聯(lián)合應(yīng)用后，對細胞遷移能力的抑制作用顯著增強，表明低劑量的小檗堿與二甲雙胍聯(lián)合后，對高表達miR-212的KYSE-450細胞的遷移能力具有顯著的協(xié)同抑制作用，其作用機制可能是通過抑制食管EMT及抑制轉(zhuǎn)錄因子Twist1的表達。