曲強(qiáng) 紀(jì)祿風(fēng) 伊琳

(1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2甘肅省人民醫(yī)院急診科)

原發(fā)性高血壓(EH)作為心血管病的危險(xiǎn)致病因素之一，常引起心、腦、腎等多個(gè)靶器官的損害〔1〕。脂質(zhì)代謝紊亂是高血壓發(fā)生的易患因素〔2〕，高血壓和脂質(zhì)代謝紊亂經(jīng)常合并存在，聯(lián)系緊密。它們能夠共同影響如缺血性心肌病、腦血管意外、腎臟損害(缺血性)等疾病的進(jìn)程。大量的研究表明體重減輕會(huì)降低血壓〔3〕。

當(dāng)歸是甘肅的道地藥材，對(duì)心腦血管及血液代謝等方面具有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)小組前期研究〔4〕證實(shí)當(dāng)歸具有輔助降壓的作用，并且在分析當(dāng)歸處理自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的基因表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)8樣分子2(Tnfaip8l2)基因。前期基因芯片研究中，筆者也發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸可使血清胎球蛋白A(Ahsg)、Toll樣受體(TLR)3等動(dòng)脈粥樣硬化抑制因子的表達(dá)上調(diào)〔5〕。根據(jù)最新進(jìn)展〔6〕筆者發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)小鼠模型時(shí)，當(dāng)歸能抑制其體重增長(zhǎng)，改變脂肪組織相關(guān)性基因的表達(dá)，并對(duì)肥胖癥的發(fā)展起到了抑制作用。本研究通過分析當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)SHR肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因Tnfaip8l2、Ahsg表達(dá)的影響，闡述當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)SHR脂代謝的改善作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只SPF級(jí)雄性SHR，8周齡，體重180～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司,動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001，動(dòng)物檢疫合格證No.1100562901。8只SPF級(jí)正常血壓雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SYXK(甘)2011-0001。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 當(dāng)歸購(gòu)自甘肅省岷縣，采用超臨界二氧化碳(CO2)萃取法，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提取當(dāng)歸揮發(fā)油(藁本內(nèi)酯含量>75%)。阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990258)，Tnfaip8l2、Ahsg抗體(北京博奧森生物有限公司)，Tnfaip8l2引物(TaKaRa公司，貨號(hào)5005)，Ahsg引物(易錦生物，貨號(hào)RmiRQ9003)，qRT-PCR儀(美國(guó)，伯樂，貨號(hào)SORVALL TENSCO)，高效RIPA裂解液(索萊寶，貨號(hào)R0010)，BCA濃度測(cè)定試劑盒(索萊寶)，聚丙酰胺配膠試劑盒(索萊寶)，Western印跡儀(美國(guó)，伯樂)，Power Lab ML125/R無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓器(澳大利亞，AD Instruments公司)，低溫?fù)u床，低溫離心機(jī)。

1.2方法

1.2.1分組和給藥 本研究的起止時(shí)間為2017年10月至2018年4月，實(shí)驗(yàn)周期為6個(gè)月。將SHR和Wistar大鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，將SHR隨機(jī)分為模型組、當(dāng)歸揮發(fā)油組、阿托伐他汀鈣組，每組8只；Wistar大鼠作為對(duì)照組。模型組、對(duì)照組不給予任何藥物處理。當(dāng)歸揮發(fā)油組、阿托伐他汀鈣組根據(jù)實(shí)驗(yàn)鼠體表面積最終確定給藥劑量，分別給予當(dāng)歸揮發(fā)油乳劑(吐溫-80助溶)100 mg/(kg·d)(含10%當(dāng)歸揮發(fā)油)、阿托伐他汀鈣溶液60 mg/(kg·d)灌胃。每日給藥1次，每周給藥7 d，連續(xù)給藥4 w，并隨著大鼠體重變化每周按時(shí)調(diào)整給藥劑量。每周第7天檢測(cè)大鼠尾動(dòng)脈血壓，每周于同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量，每只大鼠每次測(cè)量血壓5次，取平均值記錄。實(shí)驗(yàn)給藥期間，各組大鼠標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。

1.2.2樣本采集及檢測(cè)方法

1.2.2.1血樣采集及血脂檢測(cè) 給藥4 w后將大鼠禁食、不禁水12 h，采用3%水合氯醛(避光)腹腔注射，麻醉后腹主動(dòng)脈采血并分離血清，用Lisa300全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(TC),三酰甘油(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.2.2.2肝臟標(biāo)本的制備 腹主動(dòng)脈采血后將大鼠頸椎脫臼處死，開胸取出肝臟組織，10%甲醛溶液固定，石蠟組織包埋對(duì)肝臟組織進(jìn)行HE染色，觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

1.2.2.3肝臟蛋白的提取與檢測(cè) 大鼠處死后，取肝臟組織50 mg，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，加0.5 ml高效RIPA裂解液(含1%PSMF)冰上裂解20 min，4℃離心(13 000 r/min，10 min，d=12.5 cm)后得上清液為總蛋白，95℃水浴鍋煮10 min，同時(shí)采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算上樣量，而后采用免疫印跡法檢測(cè)Tnfaip8l2、Ahsg蛋白水平。以GAPDH 作為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量分析，比值表示其相對(duì)含量。

1.2.2.4肝臟總RNA的提取與檢測(cè) 采用qRT-PCR法檢測(cè)大鼠Tnfaip8l2、Ahsg mRNA表達(dá)水平。取SHR肝臟組織50 mg，DEPC水沖洗后，按TRIzol一步法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)其純度與濃度，其中260/280的比值在1.8～2.0代表其純度較好；采用1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。總RNA提取后，采用頸環(huán)結(jié)構(gòu)的MegaPlexTMRNA反轉(zhuǎn)錄引物混合物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后按照miRNA RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的半定量分析，反應(yīng)條件為95℃ 10 min(預(yù)變性)，95℃ 15 s(變性)，60℃ 30 s(退火),75℃ 30 s(延伸)，75℃ 1 min(終極延伸)，共40個(gè)循環(huán)，引物序列：Tnfaip8l2正向：5′-AGTCCTGTTCCACCCGATCAC-3′;反向：5′-CACTATTCGAAATCCACTTGACCTG-3′;Ahsg正向:5′-GGTGCTCCTTTGTTTTGCTC-3′，反向:5′-CAGCCTGAATCCCTGAAGGG-3′;GAPDH正向:5′-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3′，反向5′-CTGCCTGAATCCCTGAAGAA-3′。采用2-△△ct法計(jì)算Tnfaip8l2、Ahsg mRNA的表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及重復(fù)測(cè)量方差分析，并行兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1各組用藥前后收縮壓比較 各組給藥情況和時(shí)間在大鼠收縮壓中主效應(yīng)顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥第1、2、3、4周，當(dāng)歸揮發(fā)油組收縮壓均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，阿托伐他汀鈣組收縮壓與模型組對(duì)比無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組鼠尾動(dòng)脈收縮壓比較

與模型組比較：1)P<0.05；下表同

2.2各組血脂水平比較 與對(duì)照組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C水平高于對(duì)照組，血清HDL-C低于水平組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，各用藥組的TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，但也未見顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.3當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)各組肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞正常。與對(duì)照組比較，模型組可見脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)有小泡。當(dāng)歸揮發(fā)油組可見肝竇擴(kuò)張，糖原分解，脂肪變性消失。阿托伐他汀鈣組未見明顯異常。見圖1。

表2 各組血脂水平比較

圖1 各組肝臟組織形態(tài)學(xué)比較(HE，×400)

2.4各組肝臟Tnfaip8l2 及Ahsg mRNA水平比較 與模型組比較，當(dāng)歸揮發(fā)油組、阿托伐他汀鈣組的Tnfaip8l2及Ahsg mRNA表達(dá)水平均明顯升高，對(duì)照組Tnfaip8l2 mRNA水平明顯升高、Ahsg mRNA水平明顯減少(P<0.05)，當(dāng)歸揮發(fā)油組、阿托伐他汀鈣組之間Tnfaip8l2及Ahsg mRNA表達(dá)水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3，圖2。

表3 各組Tnfaip8l2、Ahsg mRNA相對(duì)含量比較

1、2:對(duì)照組；3、4：模型組；5、6：當(dāng)歸揮發(fā)油組；7、8：阿托伐他汀鈣組圖2 各組肝臟RNA電泳圖

2.5各組肝臟Tnfaip8l2及Ahsg蛋白水平比較 模型組肝臟Ahsg蛋白水平明顯高于對(duì)照組、Tnfaip8l2蛋白水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，當(dāng)歸揮發(fā)油組、阿托伐他汀鈣組Tnfaip8l2及Ahsg蛋白表達(dá)水平均明顯高于模型組(P<0.05)，當(dāng)歸揮發(fā)油組與阿托伐他汀鈣組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖3，表4。

圖3 各組肝臟Tnfaip8l2、Ahsg蛋白相對(duì)含量的表達(dá)

表4 各組Tnfaip8l2、Ahsg蛋白相對(duì)含量比較

3 討 論

隨著全球高血壓患病率的不斷上升，高血壓的治療方案已經(jīng)不能滿足人們對(duì)健康的需求。中醫(yī)“治病求本”和“未病先防”的理念為中藥治療高血壓病帶來了新的契機(jī)。當(dāng)歸揮發(fā)油的主要成分是藁本內(nèi)酯及阿魏酸鈉，可清除體內(nèi)氧自由基，降低氧化應(yīng)激性損傷與抗細(xì)胞凋亡，緩解腦細(xì)胞的損傷。當(dāng)歸制劑在降低血壓及改善臨床癥狀上具有明顯的療效,對(duì)調(diào)節(jié)血脂異常和免疫功能方面具有雙向作用,對(duì)致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)及血液流變學(xué)指標(biāo)有一定的下調(diào)作用〔7〕。并且有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸與苯那普利聯(lián)合降壓效果明顯好于單用苯那普利的療效〔8〕。血管內(nèi)皮功能很可能是高血壓與高脂血癥聯(lián)系的紐帶。血管腔的表面覆蓋著內(nèi)皮組織，具有調(diào)節(jié)動(dòng)脈血管收縮性、 穩(wěn)定血流及重塑血管結(jié)構(gòu)等功能。大量文獻(xiàn)報(bào)道〔9〕證實(shí)，血清游離脂肪酸濃度升高對(duì)主動(dòng)脈壓力感受反射有急性損害作用。脂代謝出現(xiàn)異常時(shí)，伴隨著血流動(dòng)力學(xué)改變，易合并動(dòng)脈粥樣硬化等疾患〔10〕。當(dāng)脂代謝合并動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，血壓也隨之升高。動(dòng)脈粥樣硬化、脂代謝紊亂、高血壓常同時(shí)存在，并互為因果。吳國(guó)泰等〔11〕在研究當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)高血脂小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用中發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油能減輕肝細(xì)胞脂肪變性、胸主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷及心肌纖維化,對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成具有抑制作用。Tnfaip8l2與血脂水平密切相關(guān)，Zhang等〔12〕研究發(fā)現(xiàn) Tnfaip8l2 缺陷鼠的頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生過程加速，認(rèn)為 Tnfaip8l2 基因是潛在的動(dòng)脈粥樣硬化抑制因子。Ahsg(α-Hs糖蛋白)在肝臟合成，具有抗炎、抑制鈣化、抗腫瘤、抑制胰島素信號(hào)通路等作用，與心血管疾病、肝硬化、脂肪肝等疾病密切相關(guān)〔13〕。本實(shí)驗(yàn)小組前期研究〔5〕證實(shí)當(dāng)歸具有輔助降壓的作用，同時(shí)在分析當(dāng)歸處理后SHR基因表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)Tnfaip8l2 基因及Ahsg基因?yàn)樯险{(diào)的差異表達(dá)基因。石向慧等〔14〕發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)SHR脂代謝有調(diào)節(jié)作用,可能通過上調(diào)TRIB1、Tlr3、AHSG等蛋白的表達(dá)量而抑制動(dòng)脈粥樣硬化,改善SHR的脂代謝而達(dá)到降壓的目的。因此，推測(cè)當(dāng)歸有可能通過這兩個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化抑制因子發(fā)揮作用。本研究顯示，Tnfaip8l2、Ahsg蛋白在當(dāng)歸揮發(fā)油組、阿托伐他汀鈣組表達(dá)上調(diào)，故推測(cè)當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過影響脂代謝進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化來達(dá)到降壓的目的。經(jīng)過當(dāng)歸揮發(fā)油治療后，SHR的Tnfaip8l2、Ahsg含量上調(diào)，并可能通過某些信號(hào)通路或者轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生作用，至于這兩個(gè)基因是通過何種信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)上調(diào)的目的及他們內(nèi)部的關(guān)聯(lián)，將是筆者下一步研究的重點(diǎn)?？傊?dāng)歸揮發(fā)油在治療老年病諸如高血壓及血脂異常方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，本課題組將進(jìn)一步探討高血壓和脂代謝發(fā)病的共同機(jī)制，并早日應(yīng)用到臨床實(shí)踐中。