陳賽明 周小柳 李志路 張?jiān)葡?周代鋒

(海南醫(yī)學(xué)院 1第一附屬醫(yī)院，海南 海口 571102；2科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)

慢性鼻竇炎(CRS)分為慢性鼻竇炎鼻息肉和單純性慢性鼻竇炎，而后者的發(fā)病率約占80%〔1～4〕。歐洲國(guó)家的CRS患者中，老年人占4.5%～12.0%，對(duì)生活質(zhì)量有顯著影響〔5〕；而17%的中國(guó)老齡人患有CRS，嚴(yán)重影響著中國(guó)老齡人的生活質(zhì)量〔6,7〕。近些年的研究表明，脂溶性維生素D與CRS存在顯著的關(guān)聯(lián)，它在體內(nèi)首先與維生素D結(jié)合蛋白(VDBP)結(jié)合，并通過(guò)維生素D受體、細(xì)胞色素P450家族等成分的作用進(jìn)行信號(hào)傳遞，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)〔8～10〕。VDBP的編碼基因?yàn)镚C，該基因存在超過(guò)2 000個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的多態(tài)性與CRS的關(guān)聯(lián)性研究數(shù)據(jù)頗少，而與海南省老齡人群CRS的關(guān)聯(lián)性研究更是尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析海南省老年CRS患者GC多態(tài)性的三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs7041、rs222016、rs4588，探討其與CRS的關(guān)聯(lián)性。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選擇海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2017年3～12月收治的37例老齡單純性CRS患者作為病例組，選擇同期在該院體格檢查科檢查的99例健康老年人作為對(duì)照組。病例組男23例，女14例，年齡60～75歲。對(duì)照組中男54例，女45例，年齡60～76歲。兩組性別及年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。樣本納入及排除標(biāo)準(zhǔn)： CRS診斷嚴(yán)格根據(jù)2012年歐洲鼻-鼻竇炎臨床診療指南(EPOS-2012)和CPOS2088的建議，CRS診斷標(biāo)準(zhǔn)包括癥狀、體征和輔助影像學(xué)檢查三個(gè)方面：(1)持續(xù)超過(guò)12 w的四種癥狀：主要癥狀：鼻塞，黏膿性鼻塞；次要癥狀：嗅覺(jué)減退，頭面部悶脹沉重感；四種癥狀中必須有兩種以上，其中主要癥狀必有其一。(2)體征：使用前鼻鏡或鼻內(nèi)鏡檢查可見(jiàn)中鼻道或嗅裂有膿性分泌物。(3)影像學(xué)檢查：包括鼻竇X線檢查、鼻竇CT檢查、鼻竇MRI檢查，其中鼻竇CT檢查是診斷CRS最直接和準(zhǔn)確的方法。所有受試者排除癌癥史、心血管疾病、自身免疫性疾病或已知感染性疾病史。

1.2基因分型方法 采集所有受試者EDTAK2抗凝血2 ml，取100 μl提取高質(zhì)量基因組DNA。委托上海捷瑞生物工程有限公司對(duì)樣本進(jìn)行基因多態(tài)性位點(diǎn)的分型。具體過(guò)程：合成引物P1(AAAGAGGAGGTGAGTTTATGGAA)、P2(GACTGGCAGAGCG-ACTAA)，擴(kuò)增包含rs7041(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：122 bp)的PCR片段；以引物P3(CTCTGTTGGTGATTTGATCTTGAA)、P4(GGCTCTGTCCTCTTACTCTTG)擴(kuò)增包含rs222016(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：103 bp)的PCR片段；以引物P5(GACTGGCAGAGCGACTAA)、P6(AAAGAGGAGGTGAGTTTATGGAA)擴(kuò)增包含rs4588(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：121 bp)的PCR片段。多重PCR的擴(kuò)增條件：95℃(3 min)；94℃、15 s,55℃、15 s，72℃、30 s共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min。純化產(chǎn)物以引物P7(CTAAAAGCAAAATTGCCTGA)、P8(ctgactgactAGGATTAACCTCCATGCTGA)及P9(ctgactgactgactgactgaTAACCAGCTTTGCCAGTTCC) 分別進(jìn)行延伸反應(yīng)。利用美國(guó)ABI公司的3730XL基因測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定及數(shù)據(jù)讀取。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 登陸網(wǎng)站https://www.snpstats.net/start.htm?q=snpstats/start.htm，利用SNPStats軟件進(jìn)行基因型云分析，基因型的組間差異用共顯性模型進(jìn)行驗(yàn)證。等位基因頻率及組間差異采用SPSS25.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均可以檢測(cè)出三種基因型，rs7041的三種基因型TT、GT、GG在病例組及對(duì)照組中的發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；該位點(diǎn)的等位基因T和G亦無(wú)組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。rs222016的三種基因型AA、AG、GG在病例組和對(duì)照組中的基因型及等位基因分布頻率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。rs4588的三種基因型CC、AC、AA在病例組和對(duì)照組中的基因型及等位基因分布頻率比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 GC基因多態(tài)性與海南省老齡CRS的關(guān)聯(lián)性〔n(%)〕

3 討 論

VDBP是維生素D進(jìn)入細(xì)胞后第一個(gè)與之結(jié)合的蛋白，在維生素D發(fā)揮作用的過(guò)程中具有極其重要的作用。該蛋白除了運(yùn)輸維生素D及其代謝產(chǎn)物外，還具有調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白、調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)、結(jié)合脂肪酸、調(diào)節(jié)骨質(zhì)發(fā)育等功能〔11～13〕。 VDBP的編碼基因GC在人群中存在廣泛多態(tài)性，而這些多態(tài)性位點(diǎn)與某些疾病的關(guān)聯(lián)性已經(jīng)被廣泛研究并報(bào)道〔14～17〕。

rs7041多態(tài)性(T→A)突變可導(dǎo)致VDBP第432位的氨基酸由天冬氨酸突變位為氨酸，rs4588(C→A)突變可導(dǎo)致VDBP第436位氨基酸由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼帷avasnazario等〔18〕發(fā)現(xiàn)rs7041與兒童哮喘密切相關(guān)，在基因型TT、TA、AA的兒童中，哮喘的發(fā)病頻率依次遞減，而rs4588與同批樣本無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性。

本研究首次報(bào)道了海南省老齡CRS人群中GC基因多態(tài)性，三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs222016、rs4588、rs7041在海南省老齡CRS人群中均具有野生型、雜合型及突變型三種基因型。三種基因型分布頻率均與海南省老齡CRS無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性；此外，等位基因的分布頻率亦無(wú)組間差異。這說(shuō)明VDBP多態(tài)性與海南省CRS的關(guān)聯(lián)性較弱。當(dāng)然，也不排除本次收集的樣本量較小的原因。