程新宇 周成美 孫潔 王露雪 王翠芳

(1沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽 110024；2錦州醫(yī)科大學(xué))

自噬是細(xì)胞在生理狀態(tài)下適應(yīng)環(huán)境的一種保護(hù)機(jī)制，自噬異常參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展病理過程〔1〕。自噬相關(guān)蛋白(Beclin)1和自噬底物蛋白(p62)是自噬相關(guān)基因。Beclin1可與磷脂酰肌醇-3-激酶(PIK3C3或Vps34)形成自噬體，在調(diào)節(jié)自噬活性參與腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔2〕。p62是C-Myc編碼的一種多功能泛素化結(jié)合蛋白〔3〕，具有選擇性自噬功能，在一定程度上反映了自噬活性〔4〕；近年來隨著研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)p62參與了自噬在內(nèi)的眾多生命活動信號通路〔5〕，其表達(dá)和調(diào)控異常與多種惡性腫瘤密切相關(guān)〔6〕，增殖指數(shù)(Ki-67)是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志，?？勺鳛轭A(yù)測惡性腫瘤發(fā)展及預(yù)后的指標(biāo)。本文旨在探討乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)及癌旁組織中Beclin1、p62和Ki-67表達(dá)差異及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2016年1月至2017年12月沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科79例IDC標(biāo)本為觀察組，20例相應(yīng)距腫瘤組織5 cm以上的癌旁正常乳腺組織標(biāo)本為對照組，所有患者臨床病理資料存檔完整。年齡30～78歲，中位年齡58歲；腫瘤直徑≤2 cm 26例，腫瘤直徑>2 cm 53例；組織學(xué)分級Ⅰ級2例，Ⅱ級54例，Ⅲ級23例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例。所有患者經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測時未經(jīng)放化療。

1.2試劑 通用型Beclin1和p62鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam 公司；Ki-67即用型鼠抗人單克隆抗體、鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶鏈接法(SP)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3SP法免疫組織化學(xué)染色 所有IDC患者腫物切除后使用10%的中性甲醛溶液固定，依據(jù)病理規(guī)定規(guī)范取材，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)石蠟脫水，檸檬酸抗原(pH6.0)高壓修復(fù)，室溫冷卻30 min；用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.4沖洗3次，每次3 min，用油筆圈定玻片上的待測組織區(qū)域；每張切片均按SP法操作流程制作(其中第一抗體Beclin1或p62稀釋比為1∶200；第一抗體Ki-67為即用型，均4℃冰箱冷藏過夜)；DAB顯色，鏡下觀察后自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS或自來水沖洗反藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封固。使用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性乳腺癌標(biāo)本切片作陽性對照。

1.4結(jié)果判讀 所有免疫組化切片由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法單獨判讀。Beclin1和p62陽性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。Ki-67陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核。在高倍鏡下任意計數(shù)5個視野，每次選取200個細(xì)胞進(jìn)行觀察，按陽性細(xì)胞所占百分比計分，評分標(biāo)準(zhǔn)為〔7〕:0分為無陽性細(xì)胞；1分為陽性細(xì)胞<10%；2分為陽性細(xì)胞占10%～30%；3分為陽性細(xì)胞>30%。按染色強(qiáng)度計分：不著色為0分；淡黃色計1分；黃色計2分；棕黃色計3分。陽性細(xì)胞百分比計分與染色強(qiáng)度計分的乘積≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、Spearman 等級相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1Beclin1、p62和Ki-67在IDC組織中表達(dá) 實驗組Beclin1陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕紅色，陽性表達(dá)率〔44.3%(35/79)〕明顯低于對照組〔100%(20/20)，χ2=4.803,P=0.028〕；p62陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，陽性表達(dá)率〔58.2%(46/79)〕明顯高于對照組〔10.0%(2/20)，χ2=6.532,P=0.011〕；實驗組Ki-67陽性表達(dá)位于細(xì)胞核，呈棕紅色，陽性表達(dá)率〔51.8%(41/79)〕明顯高于對照組〔5.0%(1/20)，χ2=7.389,P=0.007〕，見圖1。

2.2實驗組Beclin1、p62及Ki-67表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Beclin1、p62陽性表達(dá)在不同組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的IDC患者中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Ki-67陽性表達(dá)在不同組織學(xué)分級的IDC患者中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

圖1 IDC患者Beclin1、 p62、Ki67的表達(dá)(SP法，×100)

2.3實驗組Beclin1、 p62和Ki-67相關(guān)性分析 Beclin1和p62共同陽性表達(dá)14例，共同陰性表達(dá)12例，呈負(fù)相關(guān)(r=-0.330,P<0.01)；Beclin1和Ki-67共同陽性表達(dá)10例，共同陰性表達(dá)13例,呈負(fù)相關(guān)(r=-0.416,P<0.01)例；p62和Ki-67共同陽性表達(dá)30例，共同陰性表達(dá)22例，呈正相關(guān)(r=0.315,P<0.01)。

3 討 論

自噬相關(guān)蛋白表達(dá)失調(diào)可能是一種新的腫瘤發(fā)生機(jī)制〔8〕。Beclin1基因是哺乳動物中第一個被確認(rèn)的自噬調(diào)控基因，在自噬過程中Beclin1能結(jié)合激活Vps34，形成Vps34-Beclin1復(fù)合體，對自噬泡的形成起關(guān)鍵調(diào)控作用，而Beclin1缺乏則嚴(yán)重影響自噬泡的形成〔9〕。Beclin1高表達(dá)能抑制腫瘤發(fā)展，失活則促進(jìn)腫瘤發(fā)生〔10〕。本研究結(jié)果顯示Beclin1蛋白在IDC表達(dá)較癌旁正常乳腺組織明顯減低；且隨著組織學(xué)分級增加及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而Beclin1表達(dá)較少，提示自噬活性減低可能與IDC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。自噬相關(guān)蛋白p62是一種支架蛋白。自噬發(fā)生時，p62首先與細(xì)胞質(zhì)中泛素化蛋白結(jié)合，再與定位于自噬體內(nèi)膜上微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3B)形成復(fù)合物，被自噬溶酶體降解。自噬過程中，p62蛋白在細(xì)胞質(zhì)中不斷被降解，自噬被抑制時，p62蛋白在細(xì)胞質(zhì)中不斷積累，因此p62可作為反映自噬活性的標(biāo)記蛋白。雷程等〔11〕研究表明，p62蛋白在結(jié)腸癌組織細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，p62高表達(dá)提示自噬活動減弱，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。劉婷婷等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)p62在外陰鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)明顯高于外陰正常皮膚，說明外陰鱗狀細(xì)胞癌自噬活動減弱促進(jìn)了癌發(fā)生，與本實驗結(jié)果一致。本研究中p62異常聚集表明IDC自噬活性顯著減弱，自身受損、變性或衰老細(xì)胞器和大分子物質(zhì)得不到及時降解，導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生，使乳腺正常組織DNA損傷，促使正常乳腺組織向IDC進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。

以往研究提示細(xì)胞內(nèi)p62異常聚集能激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)癌基因信號〔13〕，反向調(diào)節(jié)自噬，起到促癌作用；近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)p62異常聚集，還可以激活核因子(NF)-κB和NF相關(guān)因子(Nrf)2兩個系統(tǒng)〔14〕。p62蛋白通過T6BD與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)6相互作用促進(jìn)TRAF6的寡聚化，從而導(dǎo)致TRAF6的多聚泛素化及NF-κB活化〔15〕，NF-κB是一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，涉及細(xì)胞存活及分化，NF-κB信號途徑的激活對腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移非常重要；Nrf2是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)控通路穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境〔16〕。當(dāng)氧化應(yīng)急持續(xù)存在時，p62與Nrf2競爭結(jié)合腫瘤抑制因子(Keapl)，使Nrf2入核，從而激活Nrf2靶基因轉(zhuǎn)錄，此時激活Nrf2保護(hù)了腫瘤細(xì)胞免受氧化性損傷使癌細(xì)胞生存能力增強(qiáng)。本研究表明p62表達(dá)與腫瘤的惡性行為相關(guān)，其高表達(dá)預(yù)示IDC惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，是預(yù)后差的指標(biāo)。Burdelski等〔17〕使用免疫組化技術(shù)檢測了前列腺癌組織中p62的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與本實驗結(jié)果相似。

Ki-67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，是評價惡性腫瘤細(xì)胞增殖程度最可靠的指標(biāo)。本研究提示腫瘤細(xì)胞增殖活躍，侵襲力強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。

本研究提示隨著腫瘤惡性程度增加自噬相關(guān)基因表達(dá)異常，細(xì)胞增殖更加活躍促進(jìn)了腫瘤發(fā)生，且Beclin1和p62 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示自噬相關(guān)基因表達(dá)異常能夠預(yù)示IDC侵襲力強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，自噬相關(guān)基因是判斷IDC預(yù)后的又一有效指標(biāo)。