劉滿華

(咸寧市中心醫(yī)院 湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院綜合醫(yī)療科，湖北 咸寧 437000)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一〔1〕，僅2015年我國新增胃癌病例近68萬例，約50萬例因胃癌死亡〔2〕，預(yù)后差，其5年生存率僅為7%～34%〔3〕。胃癌的病理類型以胃腺癌最多見，手術(shù)切除、化療等傳統(tǒng)治療方法效果欠佳且難以治愈。多基因、多步驟、多因素共同參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，細(xì)胞凋亡抑制和過度增殖是腫瘤形成的兩大主要機(jī)制。Livin和Survivin都屬于凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的成員〔4〕，可以直接或間接抑制凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的起始分子天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)-9及效應(yīng)分子Caspase-3/-7的活性，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中扮演重要角色。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測胃腺癌組織及正常胃組織中Livin及Survivin蛋白的表達(dá)情況，旨在探討二者在胃腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集咸寧市中心醫(yī)院2013年6月至2017年8月胃腺癌手術(shù)切除標(biāo)本56例為實驗組，其中男36例、女20例，年齡42～75歲，中位年齡63歲?；颊呔刹±碓\斷確診，術(shù)前未接受放療、化療和(或)免疫治療。按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期22例，Ⅲ期24例，無Ⅳ期病例。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者18例。組織學(xué)分級高分化3例，中分化14例，低分化29例，未分化10例。

正常胃黏膜組織56例為對照組，取自胃癌行胃切除的近側(cè)斷端胃黏膜，斷端距癌組織>5 cm，且組織學(xué)檢查顯示為正常胃黏膜。

1.2試劑 Livin兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶100)、Survivin兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶100)為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，PV-6000免疫組化試劑盒和3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司。

1.3方法 采用免疫組織化學(xué)PV-6000兩步法。標(biāo)本離體后予10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋，制成4 μm厚的連續(xù)冷凍切片，二甲苯脫蠟至水化，蒸餾水沖洗，0.01 mol/L枸櫞酸液高壓抗原修復(fù)，2 min后自然冷卻至室溫，3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min×3次。滴加一抗，4℃過夜，PBS沖洗2 min×3次，滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4評價指標(biāo) Livin、Survivin可表達(dá)于胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核。每張切片隨機(jī)選擇5個高倍視野，每高倍鏡視野均計數(shù)100個細(xì)胞，采用半定量積分法依據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率判斷染色結(jié)果。按陽性細(xì)胞百分率評分：無陽性細(xì)胞0分，陽性細(xì)胞百分率<10%1分，10%～49% 2分，50%～74% 3分，75%～100% 4分；按染色強(qiáng)度評分：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩項評分乘積≥3分判定為陽性，<3分判定為陰性。結(jié)果判定由2名有經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)師采用雙盲法認(rèn)定。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、Spearman等級相關(guān)性檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組Livin及Survivin表達(dá)情況 實驗組29例(51.8%)Livin蛋白表達(dá)陽性；36例(64.3%)Survivin表達(dá)陽性，對照組有13例(23.2%)Livin蛋白表達(dá)陽性，Survivin表達(dá)陽性為15例(26.8%)。Livin與Survivin均主要出現(xiàn)在癌組織中，在間質(zhì)細(xì)胞及臨近正常組織中則表達(dá)較少甚至不表達(dá)。實驗組Livin和Survivin蛋白陽性表達(dá)率明顯高于對照組(均P<0.01)。

2.2胃腺癌組織中Livin與Survivin表達(dá)的單因素分析 Livin和Survivin蛋白的表達(dá)與腫瘤TNM分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)，與腫瘤的病理分化程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。兩者的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 胃腺癌組織中Livin與Survivin陽性表達(dá)的單因素分析(n)

2.3胃腺癌組織中Livin與Survivin表達(dá)的關(guān)系 Livin蛋白表達(dá)陽性的29例胃腺癌組織中有24例Survivin蛋白表達(dá)陽性，27例Livin蛋白表達(dá)陰性的胃腺癌中有12例Survivin表達(dá)陽性，經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析，Livin與Survivin的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.371，P<0.01)。

3 討 論

凋亡具有獨(dú)特生物學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，是細(xì)胞死亡的一種遺傳機(jī)制〔5〕。細(xì)胞凋亡是機(jī)體內(nèi)重要的病理生理過程，在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持、胚胎的形成和發(fā)育等方面扮演著極其重要的角色。凋亡抑制在腫瘤的形成中起著關(guān)鍵作用。

IAPs是一類獨(dú)立于Bcl-2的抗凋亡蛋白家族，對于目前已發(fā)現(xiàn)的其他凋亡抑制因子家族，IAPs抑制細(xì)胞凋亡的多樣性明顯較高〔6〕，近些年來備受人們關(guān)注。Livin和Survivin都隸屬于IAPs家族，Livin基因位于人類20號染色體q13.3，轉(zhuǎn)錄后可生成成熟的mRNA亞型：Livinα和Livinβ，盡管二者在基因編碼序列上相差18個氨基酸，但其功能在本質(zhì)上并沒有差別。研究證明，Livin在多種人類惡性腫瘤中特異性高表達(dá)，如急性非淋巴細(xì)胞性白血病〔7〕、腎癌〔8〕、大腸癌〔9〕、食管癌〔10〕、肝癌〔11〕、前列腺癌〔12〕等，而相應(yīng)的正常組織中的表達(dá)水平極低甚至不表達(dá)。Survivin基因亦是IAPs家族中的成員，在迄今發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子中作用最強(qiáng)，不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)細(xì)胞增殖，還具有抑制細(xì)胞凋亡的功能，在聯(lián)系細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡中起重要作用〔13〕。Survivin表達(dá)具有高度特異性，在終末分化的成人組織(胸腺、生殖腺除外)不表達(dá)，而高表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織和多種腫瘤組織中。

本研究結(jié)果顯示，Livin和Survivin在胃腺癌組織中的陽性表達(dá)高于正常胃組織。這與文獻(xiàn)報道一致〔14，15〕，由此推斷，Livin和Survivin在胃腺癌組織中高表達(dá)，可能參與胃腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，Livin和Survivin兩種蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)與性別、發(fā)病年齡和腫瘤大小無相關(guān)性，但與腫瘤TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分化程度均有關(guān)，這與兩者在其他腫瘤組織中的表達(dá)特點(diǎn)相似〔16〕。兩者與腫瘤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，它們在胃腺癌組織中的高表達(dá)可能提示腫瘤具有強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力及高侵襲性，推測這與二者具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的功能有關(guān)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Livin和Survivin蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)率隨著腫瘤病理分化程度的增高而降低，提示Livin和Survivin兩種蛋白在腫瘤的發(fā)展過程中起重要作用，它們的表達(dá)強(qiáng)度影響腫瘤的惡性程度，有可能成為評價胃癌惡性程度的參考指標(biāo)之一。

既往研究顯示，IAPs影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為是通過改變細(xì)胞凋亡通路實現(xiàn)的〔17〕，目前的相關(guān)研究報道大多是抑制IAPs家族中的一種基因。本研究結(jié)果提示在胃腺癌中Livin與Survivin的在腫瘤組織中的高表達(dá)存在協(xié)同性，推斷，Livin和Survivin均為IAPs家族的成員，二者在結(jié)構(gòu)上具有相似性，它們的協(xié)同表達(dá)很可能存在某種共同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制細(xì)胞凋亡，這與文獻(xiàn)〔18〕所報道的在結(jié)腸癌中二者的表達(dá)具有協(xié)同性相似，但是，2種及2種以上基因相互影響的具體作用機(jī)制尚不明確，為提供更多的參考依據(jù)以證明多基因之間存在協(xié)同作用，還需要進(jìn)一步在分子水平上研究。

綜上所述，Livin及Survivin在胃腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。隨著研究的不斷深入，Livin及Survivin不但可能成為胃腺癌臨床診斷、判斷療效及監(jiān)測預(yù)后的可靠指標(biāo)，還可能為胃腺癌的靶向治療提供新位點(diǎn)。