馬淑云 雷潔 張欣 賈澄輝 張青青 周婷 鄧曉紅

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院/全科醫(yī)學(xué)院臨床實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心/婦產(chǎn)科，陜西 西安 710077；2西北婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科)

宮頸癌是女性惡性腫瘤疾病之一，死亡率在女性惡性腫瘤中居第二位，且發(fā)病年齡越來越呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)〔1〕。Ki-67是一種增殖細(xì)胞核抗原，是與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)，其功能與有絲分裂有關(guān)，是多種惡性腫瘤疾病重要生物標(biāo)志之一，通過檢測(cè)Ki-67抗原，能夠了解惡性腫瘤的細(xì)胞增殖活性，可作為疾病不良預(yù)后因素，對(duì)疾病診斷治療及預(yù)后評(píng)價(jià)有著重要的參考價(jià)值〔2,3〕。p16基因又稱為MTS1基因，該基因直接參與細(xì)胞周期調(diào)控，承擔(dān)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂與增殖的作用，宮頸癌患者常伴人乳頭瘤病毒(HPV)感染，HPV病毒表達(dá)E7蛋白將結(jié)合Rb蛋白誘使Rb蛋白失活，失活后的Rb蛋白將對(duì)p16基因產(chǎn)生反饋性刺激，導(dǎo)致其表達(dá)升高，故p16表達(dá)的升高可能與患者預(yù)后存在一定聯(lián)系〔4,5〕。表皮生長因子受體(EGFR)是酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路上的一種蛋白，由原癌基因活化后產(chǎn)生，該蛋白在正常組織與腫瘤疾病中均有表達(dá)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，現(xiàn)有報(bào)告指出，90%的宮頸癌患者存在EGFR蛋白過度表達(dá)，故該蛋白可能與宮頸癌患者的預(yù)后也有一定相關(guān)性〔6～8〕。本研究檢測(cè)了老年宮頸癌患者術(shù)后病理標(biāo)本中的Ki-67、p16、EGFR蛋白表達(dá)，并分析了患者臨床資料，旨在探討Ki-67、P16、EGFR表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 在獲得西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，選取2012年5月至2018年9月接受宮頸癌根治術(shù)治療的老年宮頸癌患者50例為研究對(duì)象，患者及其家屬對(duì)本次研究知情，并簽署知情同意書。年齡60～87〔平均(71.24±5.69)〕歲；國際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(FIGO)腫瘤分期：ⅠB期16例，ⅡA期21例，ⅡB期13例；經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)：2例為高分化期(G1級(jí))，31例為中分化期(G2級(jí))，17例低分化期(G3級(jí))。年齡：60～65歲3例，66～74歲25例，75～85歲18例，>85歲4例；民族：漢族40例，其他10例；腫瘤直徑<10 cm者30例，≥10 cm且≤20 cm者11例，20 cm<且≤30 cm者6例，>30 cm者3例；治療方法：?jiǎn)渭兪中g(shù)16例，術(shù)后化療7例，術(shù)后放療9例，術(shù)后放化療18例。

1.2入選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn) ①全部患者手術(shù)切除組織經(jīng)甲醛溶液固定，并使用白蠟包埋，每個(gè)蠟塊均實(shí)施3～4 μm連續(xù)切片并行免疫組化染色；②收集組織白蠟標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為明確的宮頸鱗狀細(xì)胞癌；③患者無其他惡性腫瘤疾??；④患者病變區(qū)域在術(shù)前均未接受其他放化療。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) ①其他黏液樣癌、腺癌等；②合并皮肌炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫系統(tǒng)疾病者；③有宮頸癌根治術(shù)手術(shù)禁忌者；④需要接受根治性放化療治療者；⑤伴腦梗死、心力衰竭、腎臟損害等基礎(chǔ)疾病者。

1.3方法

1.3.1治療方法 全部患者接受全麻下廣泛性子宮切除術(shù)與盆腔/腹主動(dòng)脈淋巴結(jié)清掃術(shù)。對(duì)于術(shù)后具有高復(fù)發(fā)因素的患者應(yīng)實(shí)施全盆化療，包括盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁組織浸潤、宮頸深肌層侵犯、手術(shù)范圍不足或手術(shù)切緣陽性者。一般盆腔放療劑量應(yīng)控制在4 500～5 000 cGy，若患者存在腹膜后區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，給予腹膜后區(qū)至少50 Gy的照射劑量。使用直線加速器6 MV X射線進(jìn)行外照射，照射方式為適形放療或調(diào)強(qiáng)放療。若患者瘤體直徑較大，或發(fā)現(xiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)前切緣陽性、侵及淋巴脈管間隙、低分化腫瘤及宮旁浸潤者，手術(shù)前后均給予患者化療治療，化療實(shí)施具體方案：75 mg/m2順鉑，分3次靜滴，1次/d；聯(lián)合1 mg/(m2·24 h)5-氟尿嘧啶持續(xù)微量泵泵入4 d。

1.3.2檢測(cè)方法 病理組織標(biāo)本取材后，使用10%甲醛溶液將標(biāo)本固定，石蠟包埋后待實(shí)施免疫組織化學(xué)染色。使用鏈霉素親和生物素-過氧化酶免疫組化法(SP)切割組織標(biāo)本，厚度3～4 μm，將切割好的標(biāo)本放入溫度為80℃烤箱中烤至30 min，脫水水化后，經(jīng)檸檬酸高壓蒸汽140℃緩沖液修復(fù)，經(jīng)處理滅活內(nèi)源性過氧化物酶；反復(fù)使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗至少3次，向內(nèi)加入經(jīng)1∶100稀釋的濃縮型鼠抗人單克隆Ki-67，并置于4℃冰箱內(nèi)；過夜使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，加入試劑盒生物素相關(guān)二抗，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次。經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺工作液溫顯色，使用顯微鏡觀察，后利用蘇木素復(fù)染，經(jīng)1%鹽酸乙醇分化5 s后使用流水沖洗約5 min；使用梯度乙醇脫水，利用松節(jié)油透明，采用中性樹膠封片。以磷酸鹽緩沖液代替一抗染色作為陰性對(duì)照物，使用美國Santa Cruz公司提供的對(duì)照物作為陽性對(duì)照。Ki-67染色若細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著則可判定為陽性細(xì)胞。上述操作中鼠抗人Ki-67單克隆抗體為克隆號(hào)MIB-1，檢測(cè)全套超敏染色劑試劑盒與二氨基聯(lián)苯胺顯色劑均產(chǎn)自美國Maxim Biotech公司；顯色劑、緩沖液、檸檬酸鈉鹽均由北京中杉金橋公司提供。三種蛋白染色方法基本一致。

1.3.3判別準(zhǔn)則 經(jīng)400倍顯微鏡可觀察到切片的總體，判別陽性的規(guī)范均依據(jù)有無染色、染色程度及顯色細(xì)胞數(shù)量聯(lián)合進(jìn)行：(+)：細(xì)胞顯色百分比為1%～30%，呈淡黃色；()：細(xì)胞顯色百分比為31%～60%，中等陽性反應(yīng)，呈黃色；()：細(xì)胞顯色百分比>60%，呈棕黃色。

1.3.4隨訪 隨訪形式為入院復(fù)查或門診，隨訪內(nèi)容包括影像學(xué)檢查、體格檢查等，除此外還應(yīng)開展電話隨訪，全部患者中無失訪者，最長隨訪時(shí)間為36個(gè)月。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理單因素采用Kaplan-Meier法檢驗(yàn)，多因素采用Cox回歸分析檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1治療與隨訪 50例老年宮頸癌患者全部手術(shù)成功，術(shù)后9例(18.00%)患者接受放療，7例(14.00%)患者術(shù)后接受化療；對(duì)于存在切緣陽性、盆腔淋巴結(jié)陽性、宮旁組織陽性者，均于術(shù)后給予盆腔放療與含順鉑的化療。50例患者中有18例(36.00%)接受放化療，化療方案為：分3 d靜滴的75 mg/m2順鉑聯(lián)合4 d微量泵泵入的1g/(m2·24 h)5-氟尿嘧啶。全部患者接受36個(gè)月的隨訪，其中位隨訪時(shí)間為19.5個(gè)月。

2.2免疫組化結(jié)果 Ki-67蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)占比最高，其次為中等陽性、弱陽性，p16蛋白經(jīng)檢測(cè)有23例呈陰性，其余陽性者以弱陽性表達(dá)為主，其次為中等陽性、強(qiáng)陽性；EGFR蛋白陰性表達(dá)5例，其余陽性者以強(qiáng)陽性表達(dá)為主，其次為弱陽性、中等陽性，見表1，圖1～3。

表1 50例老年宮頸癌患者免疫組化結(jié)果〔n(%)〕

圖1 Ki-67免疫組化染色不同表達(dá)情況(DAB,×400)

圖2 p16在宮頸癌中陽性表達(dá)(DAB,×400)

圖3 EGFR在宮頸癌中的陽性表達(dá)(DAB，×400)

2.3Ki-67、p16、EGFR表達(dá)與老年宮頸癌手術(shù)患者預(yù)后的相關(guān)性 經(jīng)Kaplan-Meier單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，Ki-67、p16、EGFR蛋白與老年宮頸癌手術(shù)患者預(yù)后相關(guān)，后經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ki-67、p16、EGFR蛋白陽性表達(dá)復(fù)發(fā)相對(duì)危險(xiǎn)度是Ki-67、p16、EGFR陰性表達(dá)的4.474、3.055、2.958倍，提示Ki-67、p16、EGFR對(duì)老年宮頸癌手術(shù)患者無進(jìn)展生存期有影響，可作為老年宮頸癌手術(shù)患者預(yù)后獨(dú)立影響因素(P<0.05)。見圖4～6，表2。

圖4 老年宮頸癌術(shù)后患者Ki-67不同表達(dá)的生存曲線

圖5 老年宮頸癌術(shù)后患者p16不同表達(dá)的生存曲線

圖6 老年宮頸癌術(shù)后患者EGFR不同表達(dá)的生存曲線

表2 Ki-67、p16、EGFR陽性表達(dá)對(duì)老年宮頸癌預(yù)后影響Cox回歸分析結(jié)果

3 討 論

宮頸癌起病前期患者無明顯癥狀，與慢性宮頸炎極為相似，部分患者可見子宮頸潤滑，尤其是老年患者常伴子宮頸萎縮，以陰道出血、陰道分泌物增加、分泌物血腥或白色或黏稠、分泌物惡臭等為主要癥狀表現(xiàn)〔9〕。早期疾病得不到重視，錯(cuò)過最佳治療機(jī)會(huì)將發(fā)展至進(jìn)展期，進(jìn)展期宮頸癌常有病變侵犯繼發(fā)性癥狀，如便秘、肛門腫脹、閉塞、下肢疼痛、下肢腫脹等，更甚者可導(dǎo)致輸尿管梗阻等并發(fā)癥，危及生命〔10〕。

Ki-67蛋白是增殖細(xì)胞核抗原，該蛋白位于染色體10，包含2個(gè)變體，11.5與12.5 kb共同組成了該基因全長，在維持細(xì)胞增殖活性過程中有著關(guān)鍵作用〔11〕。在有絲分裂階段S、G1、G2、M期Ki-67抗原將分解，因該抗原具有半衰期短的特點(diǎn)，其并不存在于G0期，故能夠直接準(zhǔn)確地反映出細(xì)胞增殖活性情況，且應(yīng)用明顯優(yōu)于DNA指數(shù)、PCNA指數(shù)及DNA倍數(shù)等諸多其他可反映細(xì)胞增殖的指標(biāo)〔12〕。一直以來，臨床實(shí)際應(yīng)用中，常以細(xì)胞核染色陽性對(duì)Ki-67進(jìn)行判別，該蛋白檢測(cè)后陽性表達(dá)越高，則提示惡性腫瘤患者分級(jí)程度越高，預(yù)后越差〔13〕。目前，Ki-67蛋白被廣泛用于非腫瘤與腫瘤的細(xì)胞增殖活性評(píng)估中，且與卵巢癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤等諸多腫瘤生物學(xué)行為息息相關(guān)，如當(dāng)Ki-67蛋白表達(dá)<5%時(shí)，胃腸道間質(zhì)瘤患者的PTEN基因點(diǎn)突變數(shù)可超過50%，患者死亡風(fēng)險(xiǎn)高〔14〕。本研究結(jié)果顯示，50例老年宮頸癌手術(shù)患者Ki-67蛋白無陰性表達(dá)，且以強(qiáng)陽性表達(dá)占比最高，其次為中等陽性、弱陽性，經(jīng)生存函數(shù)分析后發(fā)現(xiàn)，Ki-67蛋白高表達(dá)患者死亡風(fēng)險(xiǎn)高，預(yù)后差，該結(jié)果與多數(shù)研究基本一致〔15，16〕，提示Ki-67蛋白可用于老年宮頸癌手術(shù)患者預(yù)后的評(píng)估，其高表達(dá)可能是患者不良預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

p16基因被稱為多腫瘤抑制基因INR4I、MTS1或CDRN2，其編碼的p16蛋白是細(xì)胞周期素依賴性激酶阻止物，可以負(fù)調(diào)控Rb基因所控制的細(xì)胞增殖周期，普遍用于惡性腫瘤療效評(píng)估與預(yù)后分析〔17〕。隨著臨床對(duì)宮頸癌研究的深入，相關(guān)研究指出宮頸癌患者HPV感染可能會(huì)增加患者p16表達(dá)〔18〕，楊然等〔19〕研究了宮頸癌手術(shù)治療患者p16蛋白表達(dá)與術(shù)后生存期的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，p16蛋白并不能作為患者獨(dú)立的預(yù)后因素，且在生存分析中無意義；而本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Kaplan-Meier單因素分析p16蛋白有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述結(jié)果有差異，這可能是因?yàn)楸狙芯恐兴x患者均為年齡≥60歲的老年患者，患者年齡大，身體素質(zhì)差，預(yù)后不佳，故p16蛋白對(duì)其預(yù)后的預(yù)測(cè)更為敏感。但因本研究與其他類似研究還有一定差異，故尚不能將p16完全作為宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，還應(yīng)在后續(xù)的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

EGFR是一種原癌基因表達(dá)產(chǎn)物，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，該蛋白在放療抵抗的RTK-PI3K/AKt獲得性途徑中起到關(guān)鍵作用。EGFR的表達(dá)與諸多因素有關(guān)，Giordano等〔20〕研究表明，老年宮頸癌患者的EGFR陽性率(91%)是青年患者的1.18倍，而在本研究中，50例老年宮頸癌手術(shù)患者的EGFR陽性率為90%，與該報(bào)道結(jié)果基本一致，可見年齡對(duì)宮頸癌患者EGFR蛋白的影響。而研究了EGFR與患者預(yù)后的相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，EGFR陽性表達(dá)患者的生存優(yōu)勢(shì)不及陰性表達(dá)者，且經(jīng)Kaplan-Merier生存曲線與Cox生存回歸分析檢查均有意義，表明EGFR蛋白與老年宮頸癌手術(shù)患者預(yù)后有一定相關(guān)性，隨著該蛋白陽性表達(dá)增加，患者死亡風(fēng)險(xiǎn)提高，無進(jìn)展期生存時(shí)間縮短。但因EGFR蛋白在宮頸癌患者中的表達(dá)仍存在一定陰性率，故尚不能將其作為患者獨(dú)立的預(yù)后因素，僅能夠認(rèn)為其與患者預(yù)后相關(guān)。

綜上所述，Ki-67、p16、EGFR蛋白表達(dá)均與老年宮頸癌手術(shù)患者預(yù)后有一定相關(guān)性，其中Ki-67、EGFR蛋白的高表達(dá)可能預(yù)示著高死亡風(fēng)險(xiǎn)，可作為預(yù)后獨(dú)立因素，而p16蛋白因其陽性情況相對(duì)較弱，可能僅與預(yù)后相關(guān)，尚不能作為預(yù)后獨(dú)立因素。