李斯 孫雅楠

(唐山市工人醫(yī)院 1心內(nèi)四科，河北 唐山 063000；2內(nèi)分泌二科)

miR-9-3p是microRNA(miR)家族成員之一，其基因定位于人15號染色體。目前研究證實血漿中miR-9-3p能夠參與機體膽固醇代謝、調(diào)節(jié)心肌細胞血管新生能力及心肌的生物學功能〔1～3〕。冠心病(CHD)患者血漿miR-9-3p表達水平的研究鮮有報道。本研究分析冠狀動脈病變嚴重程度Gensini評分與血漿miR-9-3p表達水平的相關性，旨在探討血漿miR-9-3p水平在CHD病情評估及診療中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年1月至2015年6月唐山市工人醫(yī)院心內(nèi)科就診的不穩(wěn)定型心絞痛(UA)患者50例為UA組，納入標準：(1)參照2011《美國心臟學會/美國心臟病學會不穩(wěn)定型心絞痛/非ST段抬高心肌梗死指南》及加拿大心絞痛分級3/4級標準，且必須具有以下至少一個特征：①1個月內(nèi)原有心絞痛加重或發(fā)作頻繁(發(fā)作頻率增加，時間延長，程度加重)；②病程在1個月以內(nèi)新發(fā)生的心絞痛(從無心絞痛，或有心絞痛病史但在半年內(nèi)未發(fā)生心絞痛)；③靜息型心絞痛：心絞痛發(fā)生在休息或安靜狀態(tài)；④發(fā)作持續(xù)時間相對較長，含硝酸甘油效果欠佳，病程在1個月內(nèi)。(2)冠狀動脈造影顯示至少一支冠狀動脈血管直徑狹窄≥50%。排除標準：(1)先天性心臟病、心臟瓣膜病患者、嚴重充血性心力衰竭〔紐約心臟病協(xié)會(NYAH)分類Ⅳ級〕或心源性休克。(2)伴有腎臟疾病、肝臟疾病、免疫性疾病、惡性腫瘤、血栓性疾病、嚴重貧血和出血性疾病等；(3)伴有各種急慢性炎癥及創(chuàng)傷等情況；(4)血壓≥180/110 mmHg者。同期年齡、性別與之相匹配的健康體檢人員30例為對照組。本研究由唐山市工人醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2標本采集 研究對象均禁食8 h，于冠脈造影前，清晨空腹肘靜脈采血。

1.3冠脈造影檢查 患者均具有冠狀動脈造影指征且無禁忌證，由經(jīng)驗豐富的心血管介入醫(yī)師行冠狀動脈造影術，必要時行球囊擴張及支架植入術。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的美國AHA血管分段標準將冠狀動脈分為15段，根據(jù)Gensini評分準則確定冠狀動脈粥樣硬化的嚴重程度，將病變血管分為左主干、左前降支、回旋支和右冠狀動脈；每支血管根據(jù)狹窄程度進行分值設定：管腔狹窄≤25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計4分，76%～90%計8分，91%～99%計16分，100%完全閉塞計32分；不同節(jié)段冠狀動脈乘以相應系數(shù)：左主干病變×5.0；左前降支近段×2.5，中段×1.5，遠段×1.0；第一對角支×1.0；第二對角支×0.5；左回旋支近段×2.5，中段×1.5，遠段和后降支均×1.0，后側支×0.5；右冠狀動脈近、中、遠段和后降支均×1.0。Gensini評分為各節(jié)段冠狀動脈血管分值之和，得分越高說明狹窄程度越嚴重。

1.4血漿總RNA的提取 使用mirVana Paris試劑盒提取血漿總RNA，按照說明書操作，置于-80℃冰箱凍存。

1.5cDNA合成 應用實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(PCR)(Taqman探針法)配制RT-PCR反應體系，總反應體系共8 μl，10×緩沖液0.8 μl、dNTP 0.2 μl、抑制劑0.1 μl、RNA 4.5 μl、無水RNase 0.4 μl、RNA引物1.5 μl、RTase 0.5 μl，全過程需在冰浴上操作。反應條件為：16℃ 60 min、42℃ 60 min、85℃ 5 min、4℃循環(huán)。

1.6qRT-PCR 配制qRT-PCR 反應體系 2× TaqMAN universal PCR Master混合物10 μl、cDNA 4 μl、無水RNase 5 μl、TaqMAN探針1 μl，總反應體系共20 μl；反應條件為：95℃10 min起始模板預變性，95℃15 s中模板變性、60℃60 s退火循環(huán)40次；每個樣本均做副管，重復3次，記錄實驗CT值，取平均值，后經(jīng)2-△CT轉換后進行統(tǒng)計學分析。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0及GraphPAD Prism5.0 統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗、t檢驗、Mann-Whitney檢驗；應用受試者工作特征(ROC)曲線分析計算曲線下面積(AUC)和95%可信區(qū)間(CI)；相關性采用Spearman相關分析和多元逐步回歸分析。

2 結 果

2.1兩組基本資料比較 兩組性別、年齡、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、舒張壓(DBP)比較未見顯著性差異(P>0.05)。兩組總膽固醇(TC)、收縮壓(SBP)水平存在顯著性差異(P<0.05)(表1)。

表1 兩組基本特征

2.2兩組血漿miR-9-3p的表達水平 UA組血漿miR-9-3p的表達水平〔0.001 9(0.001 3～0.002 3)〕與對照組〔0.003 2(0.002 5～0.005 7)〕存在顯著性差異(U=186.00，P<0.01)。

2.3ROC曲線分析miR-9-3p對UA的診斷價值 AUC為0.88(95%CI，0.80～0.95，P<0.05)，說明miR-9-3p對UA診斷有一定準確性(圖1)。

2.4血漿miR-9-3p 表達水平與UA各因素相關性 血漿miR-9-3p與年齡、性別、FPG、TC、TG、HDL-C、SBP、DBP未見顯著相關性(r=0.22、-0.19、-0.09、-0.21、-0.21、-0.01、-0.10、-0.04，均P>0.05)，與LDL-C、Gensini評分負相關(r=-0.41、-0.39，均P<0.05)。

圖1 ROC曲線分析血漿miR-9-3p對UA 的診斷價值

2.5Gensini評分與血漿miR-9-3p 表達水平相關性 以UA組Gensini評分為因變量，血漿miR-9-3p、年齡、性別、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、SBP、DBP為自變量進行多元逐步回歸分析，Gensini評分與血漿miR-9-3p表達水平呈顯著負相關(r=-0.39，P<0.05)。

3 討 論

miR廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，miR具有較高的穩(wěn)定性，即使在反復凍融(4～-80℃)、pH改變及DNA和RNA裂解酶等極端條件下也不易降解，能夠穩(wěn)定地存在于細胞及循環(huán)系統(tǒng)中〔4〕。同一個體在相同狀態(tài)下血漿miR表達譜大致相同，在疾病狀態(tài)下，miR會選擇性地從組織細胞釋放到外周血中發(fā)揮作用或通過血液傳遞到受體細胞發(fā)揮作用〔5〕，這就使得血漿中miR的表達水平發(fā)生變化，且血漿中miR變化要早于蛋白類標記物〔6〕，以上特點使血漿miR具有成為一種全新疾病檢測標記物的潛能。

目前國際關于miR與CHD研究的報道顯示，在CHD發(fā)病過程中血漿miR表達水平會發(fā)生顯著變化，并與冠脈病變嚴重程度具有相關性，在CHD診斷及病情評估方面起到重要作用。Chen等〔7〕研究顯示，與健康人群相比，急性心肌梗死(AMI)患者血漿miR-499表達水平顯著升高，并與Gensini評分顯著正相關。Wang等〔8〕的研究顯示，AMI患者血漿中miR-21-5p與miR-361-5p表達水平顯著升高，miR-519e-5p 表達水平顯著下降，ROC曲線分析顯示以上3種microRNA對AMI均具有一定診斷意義。Ding等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)CHD患者血漿miR-125b表達水平下降，Gensini評分與miR-125b表達水平負相關。Wang等〔10〕研究顯示AMI病人血漿miR-133a表達水平顯著升高，ROC曲線分析顯示，血漿miR-133a對于CHD的診斷具有較高準確性。還有研究報道顯示 CHD 患者較胸痛患者血漿miR-155表達水平顯著降低，Spearman相關分析顯示其與Gensini評分顯著負相關〔11〕。Gensini評分是目前廣泛應用于評估CHD病變程度和冠狀動脈血管受累范圍的指標。

miR-9-3p最初在腫瘤性疾病中研究較多，miR-9-3p在腫瘤形成的病理過程中參與血管新生，目前研究顯示miR-9-3p在心血管發(fā)育乃至心血管疾病的病理過程中發(fā)揮一定作用。研究表明miR-9-3p可以通過靶向抑制心肌細胞血小板衍生生長因子受體-β信號，導致心肌細胞旁分泌血管新生能力顯著降低〔12〕。研究表明miR-9-3p的靶向抑制基因包括核因子激活T細胞c3和心肌素，兩者是共同構成心肌肥厚的主要因素，miR-9-3p可以通過抑制核因子激活T細胞c3和心肌素的表達，減弱心臟肥大并改善心臟功能〔13〕。研究表明miR-9-3p也可以通過靶向抑制脂肪酰輔酶A(ACAT)的基因表達，調(diào)節(jié)膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)〔3〕，ACAT1的過度表達能夠?qū)е录毎麅?nèi)堆積過量膽固醇，促進巨噬細胞向泡沫細胞分化，最終導致動脈粥樣硬化〔14〕。研究表明，在衰老的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中miR-9-3p表達水平顯著升高〔15〕，miR-9-3p能夠通過激活磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)信號通路促進血管生成〔16〕，以上研究結果均證實血漿miR-9-3p與冠狀動脈粥樣硬化性疾病密切相關。

綜上，UA患者血漿miR-9-3p表達水平顯著降低對于UA診斷有一定準確性，且Gensini評分與血漿miR-9-3p表達水平呈負相關。本實驗并未闡明miR-9-3p參與CHD形成的具體機制，在今后的研究中應擴大樣本量，加入穩(wěn)定型心絞痛及AMI病例和細胞功能實驗，進一步明確miR-9-3p在CHD發(fā)病中的作用。